柴胡中主要成分含量測定方法的建立

柴胡中主要成分含量測定方法的建立

肝臟保護(hù)片能平肝理氣，健脾消食。具有降低轉(zhuǎn)氨酶作用。處方來源于《傷寒論》中小柴胡湯和茵陳蒿湯的配伍原理,結(jié)合現(xiàn)代藥學(xué)研究及臨床驗證,使其組方更加合理。護(hù)肝片收載于《中華人民共和國藥典》2010年第一版一部中,標(biāo)準(zhǔn)中僅載入了五味子和豬去氧膽酸的鑒別方法,文獻(xiàn)中多見對護(hù)肝片中五味子、茵陳和豬膽粉的報道。柴胡是方中主要成分之一,為完善現(xiàn)有護(hù)肝片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),本文主要對柴胡中主要成分柴胡皂苷建立含量測定的方法。1材料表面1.1高效液相色譜法電子天平BT211D;可裁剪型薄層層析板;Goodsee-I薄層色譜攝影儀,CAMAGTLCSCANNER3,CAMAGLINOMAT半自動點(diǎn)樣儀;水浴鍋;電熱鼓風(fēng)干燥箱;離心機(jī)-AnkeTDL80-2B;平頭微量進(jìn)樣器-10?L。1.2對二甲基氨基苯甲醛,三氯甲烷柴胡對照品a(中國生物制品檢定所),柴胡對照品b2(中國生物制品檢定所),甲醇,甲酸,正丁醇,氫氧化鈉,氨水,濃硫酸,無水乙醇,石油醚,對二甲氨基苯甲醛,三氯甲烷。1.3試驗樣本各批護(hù)肝片的廠家及批號見(表1)。2方法和結(jié)果2.1展開劑的制備用刻度吸管分別吸取氯仿9mL、甲醇3mL、甲酸0.2mL,置于同一具塞錐形瓶中,振蕩使充分混勻,即得展開劑。顯色方法,2%對甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液,置于烘箱中60°C烘5min。掃描方法:以單波長λ=538nm吸收掃描,光束狹縫6.0mm×0.45mm,采用外標(biāo)二點(diǎn)法,以積分峰面積同板測定柴胡皂苷a(d),b2(b1)的含量。2.2空白對照溶液的制備2.2.1供試品的制備取護(hù)肝片3片,研細(xì),溶解于3mL的石油醚中,提取片刻,離心,除去上清液,至水浴鍋中蒸干,殘渣溶解于3mL的水中,每次加4mL的正丁醇,共提取三次。振搖片刻后離心,取上清液,加入4mL的氫氧化鈉,反應(yīng)片刻后離心,取上清液,加入氨試液4mL,離心,取上清液,加入蒸發(fā)皿中蒸干,殘渣用適量甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至離心管中,定容至2mL。2.2.2空白對照溶液的制備按護(hù)肝片處方量的二十分之一備料,按如下方法制備成陰性空白樣品。方中六味,綠豆粉碎成細(xì)粉;茵陳、板藍(lán)根加水煎煮二次,每次2小時,濾過,濾液合并,靜置24小時,取上清液于烘箱中加熱干燥成干浸膏,用研缽研成細(xì)粉;五味子粉碎成粗粉,用適量75%乙醇超聲提取2次,每次2小時,合并提取液,靜置24小時,取上清液,回收乙醇并濃縮至適量,與綠豆細(xì)粉、豬膽粉、上面干燥所得的細(xì)粉及適量的輔料混勻,干燥得顆粒。自制樣品未壓片。取自制對照樣品適量,按“供試品溶液的制備”的方法制備成溶液。2.3混合對照品溶液2.3.1柴胡皂苷對照品的制備分別精密稱取經(jīng)40°C、P2O5、真空干燥處理12小時的柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2各6～7mg,置同一10mL容量瓶中,并加甲醇定容至刻度,搖勻,即得每mL含柴胡皂苷a、b2各0.6～0.7mg的混合對照品溶液。2.3.2柴胡對照藥材溶液的制備取柴胡藥材粗粉適量,加入甲醇超聲提取30min,離心后取上清液,即得到柴胡對照藥材(直接提取)的溶液(0.1g/mL)。柴胡對照藥材溶液(煎煮)按供試品方法提取(0.1g/mL).2.4藥材提取物、成分配液護(hù)肝片供試品點(diǎn)樣6μL,空白對照溶液5μL,柴胡皂苷a、b混合溶液3μL、柴胡對照藥材溶液(煎煮)5μL、柴胡對照藥材溶液(直接提取)5μL,點(diǎn)在一塊薄層板上。圖1(Ⅰ、Ⅱ)中點(diǎn)1為供試品溶液,點(diǎn)2為陰性樣品溶液,點(diǎn)3為柴胡皂苷a、b2混合對照品溶液,點(diǎn)4為柴胡對照藥材溶液(煎煮),點(diǎn)5為柴胡對照藥材溶液(直接提取)。2.5柴胡皂苷a標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精密吸取“2.2.1”項下溶液2、4、6、8、10μL點(diǎn)于同一薄層板上,每量2點(diǎn),依量循環(huán)點(diǎn)樣,展開,顯色,掃描,以各點(diǎn)每量吸收值均數(shù)為縱座標(biāo),點(diǎn)樣量為橫座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得柴胡皂苷a的線性回歸方程:Y=2.23X×103+5.2×102(r=0.996,線性范圍1.30～6.50μg)。柴胡皂苷b2的線性回歸方程:Y=2.80X×103+7.7×102(r=0.999,線性范圍1.32～6.61μg)。2.6確定柴胡皂苷b的r.s.d同板精密度:取上述所制的供試品溶液,共點(diǎn)6個點(diǎn),每個點(diǎn)樣5?L,展開,顯色后,根據(jù)掃描所得峰面積的數(shù)值計算R.S.D。計算可得其柴胡皂苷a的R.S.D為3.77%,柴胡皂苷b的R.S.D為2.05%。異板精密度:取上述所制得供試品溶液,點(diǎn)在6塊板上,每個板點(diǎn)3個點(diǎn),每個點(diǎn)樣5?L,展開,顯色后,根據(jù)掃描所得峰面積的數(shù)值計算R.S.D。計算可得其柴胡皂苷a的R.S.D為3.83%,其柴胡皂苷b的R.S.D為2.87%。2.7供試品溶液的穩(wěn)定性溶液穩(wěn)定性:取上述所制得的供試品溶液,取時間0h,1h,2h,3h,4h,5h,各點(diǎn)樣5?L,共點(diǎn)3個點(diǎn),展開,顯色后,根據(jù)掃描所得柴胡苷a的RSD為3.24%,柴胡皂苷b2的R.S.D為2.29%,均小于5%。薄層顯色穩(wěn)定性:取上述制得的供試品溶液,點(diǎn)3個點(diǎn),每個5?l,展開,顯色后,在時間0min,10min,20min,30min,40min,50min,60min對皂苷斑點(diǎn)進(jìn)行掃描測定,根據(jù)掃描計算所得RSD為柴胡皂苷a的RSD為2.34%,柴胡皂苷b2的RSD為2.02%。由上述可得結(jié)論可知,護(hù)肝片供試品溶液在6小時內(nèi)較為穩(wěn)定,薄層顯色后在1小時內(nèi)測定結(jié)果,誤差在允許范圍內(nèi)。在薄層顯色穩(wěn)定性的實驗中,柴胡皂苷的峰面積變化較小,薄層板對顯色后的結(jié)果影響較小。2.8樣4:5?l取上述所制得的6個供試品,分別點(diǎn)在6塊板上,每個板上點(diǎn)三個點(diǎn),每個點(diǎn)樣5?L,展開,顯色后,掃描。根據(jù)實驗所得峰面積計算可得其柴胡皂苷a的RSD為4.56%,柴胡皂苷b的R.S.D為4.49%,變異系數(shù)均在5%的范圍內(nèi),故在相同條件下,重復(fù)該次實驗所得的柴胡皂苷的結(jié)果變化較小。2.9供試品溶液的制備取6份已知含量的護(hù)肝片,加入適量的柴胡皂苷對照品溶液,按照重復(fù)性實驗的溶液提取制備步驟,制得供試品。實驗常用該方法用來評價測定結(jié)果與真實值或參考值接近的程度。結(jié)果見表2。2.10試驗結(jié)果見表2按表1中的5種護(hù)肝片試藥,每種護(hù)肝片取5片,按重復(fù)性實驗的方法制得5個供試品。用外標(biāo)二點(diǎn)法,分別精密吸取供試品溶液5?L及對照品溶液2?L,10?L,交叉點(diǎn)于同一薄層板上,各點(diǎn)2點(diǎn)。如法展開、顯色、掃描,按峰面積計算供試品中各柴胡皂苷的含量。每份供試品溶液另做平行試驗1次,即每一供試品重復(fù)測定2次。所得結(jié)果見(表3)。以上數(shù)據(jù)表明,江西匯仁藥業(yè)有限公司所生產(chǎn)的護(hù)肝片質(zhì)量較好,且不同批號之間的護(hù)肝片的質(zhì)量穩(wěn)定。修正藥業(yè)和哈藥制藥集團(tuán)六廠所生產(chǎn)的護(hù)肝片的質(zhì)量稍差,其中柴胡皂苷a的含量較少,可能是在柴胡煎煮過程中,柴胡皂苷a大部分都轉(zhuǎn)化為柴胡皂苷b的緣故。山西云鵬制藥有限公司所生產(chǎn)的護(hù)肝片質(zhì)量很差,幾乎檢測不出柴胡皂苷的量。3更有利于確定柴胡皂苷的含量進(jìn)行鑒別和分析后,發(fā)現(xiàn)有多家生產(chǎn)的護(hù)肝片質(zhì)量參差不齊,在對護(hù)肝片進(jìn)行柴胡皂苷的含量測定后發(fā)現(xiàn)幾家生產(chǎn)的護(hù)肝片質(zhì)量差異較大。通過對護(hù)肝片中柴胡皂苷的鑒定和評價,可以得到采用薄層對柴胡皂苷定性比高效液相色譜分析更具有科學(xué)性,合理性。用HPLC法測定復(fù)方制劑中柴胡皂苷的含量時,由于柴胡皂苷a(d)僅有末端吸收,且干擾成分與柴胡皂苷很難達(dá)到基線分離,影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時對柴胡皂苷分析中,通過回收率、重復(fù)性、精密度和穩(wěn)定性