淺析甾醇側鏈切除的微生物轉化技術

淺析甾醇側鏈切除的微生物轉化技術

微生物轉化一直受到針灸和莫哈藥房的影響。為了使用低價天然材料進行生產原料，提高微生物轉化效率一直是人們的方向。傳統(tǒng)甾體醫(yī)藥生產工藝采用甾體皂甙類自然資源為原料的化學合成途徑。由于自然資源的逐漸匱乏,化學合成工藝路線繁長、“三廢”污染嚴重,上世紀60年代人們開始采用微生物轉化廣泛存在于動、植物體內的甾醇。如圖1所示,AD(androst-4-ene-3,17-dione)和ADD(androsta-1,4-diene-3,17-dione)已成為世界市場的重大產品,每年有1000噸以上的甾醇用于ADD/AD生產。這一變革歸功于篩選到了能夠將谷甾醇、豆甾醇和膽固醇等動植物甾醇轉化為關鍵中間體的微生物菌株和開發(fā)了能用于大規(guī)模工業(yè)化生產的微生物轉化技術。本文綜述微生物轉化技術的新進展以及我們最近開發(fā)的濁點系統(tǒng)兩相分配生物反應器技術。1有機溶劑進料法1944年,Turfitt發(fā)現(xiàn)Mycobacterium能利用膽固醇或植物甾醇為唯一碳源進行生長和繁殖。起初采用添加酶抑制劑的方法抑制1-2位脫氫酶或9α-羥化酶的活性,后來通過微生物誘變,獲得了阻斷1-2位脫氫酶和9α-羥化酶的突變株或阻斷9α-羥化酶的突變株,使甾醇側鏈切除的微生物轉化進入了應用時期。甾醇在水中溶解度很小,甾醇側鏈切除的微生物轉化常常不是由酶催化反應速率控制,而是由底物的傳遞過程速率控制。生物轉化的底物是有機物,在水中溶解度一般較小,生物轉化疏水性底物是轉化技術的共同問題。如圖2所示,酶轉化不溶性底物常采用的策略有均質有機溶劑、兩相系統(tǒng)/乳化、兩相膜生物反應器和反膠束系統(tǒng)等。甾醇側鏈切除是多酶催化過程,必須采用全細胞轉化,和酶在非水溶劑中穩(wěn)定性相比,微生物在非水溶劑中的生物相容性更加復雜。早期解決甾醇側鏈切除轉化效率的方法是采用有機溶劑進料,如將甾醇脂質體化、二甲基亞胺飽和溶液等。由于水溶性有機溶劑的生物相容性差,培養(yǎng)基中有機溶劑濃度受到限制,增加底物溶解的作用難以發(fā)揮。采用添加表面活性劑等的乳濁液進料方法也得到廣泛研究,如環(huán)糊精、卵鱗脂、聚氧丙烯醇、Tween80等,表面活性劑一方面增加底物的溶解度,同時也改變細胞膜的通透性,對加快底物的傳遞和與微生物作用應該會產生明顯效果,但實際上并不理想。兩相膜生物反應器和反膠束系統(tǒng)應用于甾醇側鏈切除的微生物轉化還未見文獻報道。微生物轉化甾醇側鏈切除的效率不但受底物溶解度的影響,還受到底物、產物抑制,產物進一步降解等的制約。采用樹脂等吸附劑的原位產物去除(in-situproductremoval)方法實現(xiàn)了解除產物抑制和保護產物進一步降解,在底物濃度達到10g/L時也獲得了較高的產物得率。最近發(fā)展起來的兩相分配生物反應器,萃取相不但充當?shù)孜锏膬Υ鎺?還充當產物的萃取劑,同時實現(xiàn)底物的增溶和產物的原位去除。兩相分配生物反應器應用于微生物轉化甾醇側鏈切除的典型實例如表1所示。雙水相系統(tǒng)因生物相容性好而被應用于甾醇側鏈切除的微生物轉化,但多聚物的增溶能力和價格限制了其在工業(yè)中應用。相對于水溶性的均質有機溶劑,有機溶劑兩相系統(tǒng)的生物相容性有提高,在甾醇側鏈切除的微生物轉化中研究較多。但有機溶劑仍有生物相容性問題,難度仍很大。細胞固定化技術是提高微生物生物相容性的有效途經。文獻報道了在有機溶劑兩相系統(tǒng)中固定化細胞的催化活性明顯高于游離細胞。文獻還報道了在雙水相系統(tǒng)中采用固定化細胞的磁懸浮方法而改變細胞在兩相系統(tǒng)中的分配,使微生物轉化效率提高。有機溶劑兩相系統(tǒng)雖有明顯的優(yōu)勢,但培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分在有機溶劑中存在去極化現(xiàn)象,降低了微生物的生物利用度;底物在有機溶劑兩相系統(tǒng)中高度的不均勻分配,導致發(fā)生反應的溶液相中底物濃度很低,降低了底物的反應速率;有機溶劑的揮發(fā)性,增加了環(huán)境、安全的復雜性等。甾醇側鏈切除的微生物轉化過程一般都是將甾醇加入微生物的轉化培養(yǎng)基中,以甾醇為碳源或唯一碳源。這種方法的主要缺點是不能實現(xiàn)高細胞密度轉化和生長培養(yǎng)基使下游分離困難?？朔@一缺點的方法之一是采用休止細胞生物轉化,將培養(yǎng)好的細胞加入營養(yǎng)成分缺乏的介質中進行生物轉化。這一方法還能減少其它微生物污染的可能性。Cabral等在有機溶劑兩相系統(tǒng)中研究了甾醇側鏈切除的微生物轉化,測定了細胞量、微生物酶活性等重要數(shù)據(jù),為甾醇側鏈切除采用休止細胞轉化作了探索。甾體羥化有采用休止細胞的報道,但甾醇側鏈切除是多酶催化,還少見報道。2濁點系統(tǒng)的開發(fā)非離子表面活性劑溶液不同于離子型表面活性劑溶液的特征之一是在一定溫度或一定添加物濃度的條件下,溶液自動分相而形成表面活性劑濃度很低的稀相和富含表面活性劑的凝聚層相(Coacervatephase),稀相表面活性劑濃度大于或等于臨界膠束濃度。溶液分相時的溫度稱為濁點,這一系統(tǒng)稱為濁點系統(tǒng)(cloudpointsystem,CPS)。在分離科學領域常利用溶質在兩相中不均勻分配而實現(xiàn)濁點萃取。采用Mycobacteriumsp.NRRLB-3683轉化植物甾醇時獲得主產物ADD、副產物AD和微量副產物20α-羥甲基-孕甾-1,4-二烯-3-酮(圖3)。在一定濃度的TritonX-100和TritonX-114組成的表面活性劑溶液中,在轉化培養(yǎng)溫度和產物的誘導下表面活性劑溶液會形成濁點系統(tǒng),我們將濁點系統(tǒng)開發(fā)為新的兩相分配生物反應器技術成功地應用于甾醇側鏈切除。數(shù)學模擬濁點系統(tǒng)中甾醇側鏈切除過程確定了表面活性劑濃度是轉化過程的重要可調參數(shù),進一步優(yōu)化了生物轉化過程的操作參數(shù),使膽固醇添加濃度達到14.5g/L,產物ADD和AD濃度達到10g/L以上,摩爾轉化率高達93%。如圖4所示,濁點系統(tǒng)比常規(guī)溶液系統(tǒng)和其它兩相生物反應器有優(yōu)勢。在水中,產物抑制微生物轉化;在雙水相系統(tǒng)中,高溶劑價格使其工業(yè)應用不現(xiàn)實;在有機溶劑兩相系統(tǒng)中,有機溶劑的生物毒性必須使用固定化細胞;在濁點系統(tǒng)中,不論是活細胞還是休止細胞,非固定化細胞微生物轉化都能順利進行。類似于反膠束系統(tǒng),濁點系統(tǒng)的凝聚層相形成W/O型微觀乳濁液,對疏水性底物具有增溶作用,使底物的溶解度增加,充當著底物的儲存庫。而且濁點系統(tǒng)凝聚層相的微觀乳濁液是表面活性劑和水形成的,消除了有機溶劑的影響。濁點系統(tǒng)中生物轉化液的薄層層析譜如圖5,濁點系統(tǒng)具有一般兩相分配生物反應器中底物、產物在兩相中不均勻分配的特征,實現(xiàn)了底物的緩控釋,解除了底物抑制。產物的萃取解除了產物抑制和降解。我們在濁點系統(tǒng)中證實了微生物轉化反應和微生物細胞生長的可分離性,成功地實現(xiàn)了甾醇側鏈切除的休止細胞微生物轉化。HPLC分析活細胞轉化7d和休止細胞轉化4d時轉化液的結果如圖6所示,轉化的主產物ADD、副產物AD和微量副產物20α-羥甲基-孕甾-1,4-二烯-3-酮的出峰時間分別為3.6min、4.3min和6.2min。休止細胞生物轉化較活細胞生物轉化的產物ADD濃度增加,轉化周期縮短,可能是實現(xiàn)了高細胞密度轉化所致。甾醇側鏈切除形成產物ADD存在母環(huán)的△1-2脫氫反應,這是依靠輔酶催化的全細胞轉化,輔酶的連續(xù)再生一般需要活細胞代謝來維持。休止細胞和活細胞生物轉化的HPLC圖譜基本一致,這表明休止細胞維持了活細胞的生命活力。但休止細胞和活細胞生物轉化相比,副產物AD的比例降低,微量副產物20α-羥甲基-孕甾-1,4-二烯-3-酮量略有有升高,表明全細胞生物轉化甾醇側鏈切除體系有