高粱花葉病毒和甘蔗花葉病毒誘導玉米葉片細胞超微結(jié)構(gòu)的比較_第1頁
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高粱花葉病毒和甘蔗花葉病毒誘導玉米葉片細胞超微結(jié)構(gòu)的比較

高粱花葉病毒(srvm)和甘蔗花葉病毒(scvm)是甘薯病毒科和甘薯病毒(cy)的成員,其主要分布僅限于一些cm伏植物。病毒粒子長度約750nm,均由蚜蟲傳播,在一些寄主上引起相似的癥狀,并經(jīng)常復合侵染寄主。SCMV是廣泛分布于世界各地的重要病毒病原,可導致甘蔗、玉米、高粱的產(chǎn)量大幅下降和品質(zhì)降低,給生產(chǎn)造成重大損失。SrMV的報道則相對較少,這是由于20世紀90年代以前,SrMV被認為是SCMV的一個株系,隨著SrMV與SCMV被劃分為兩種不同的病毒,相關(guān)作物病害的病原鑒定已成為必要。高文臣等(2000)確定白草花葉病病原為SrMV,蔣軍喜等(2002)將杭州地區(qū)的甘蔗花葉病病原鑒定為SrMV,程曄等(2001)將杭州地區(qū)的玉米花葉病病原鑒定為SCMV。為了進一步了解這兩種分類學上較近緣的病毒侵染相同的玉米寄主后細胞超微結(jié)構(gòu)變化,本文系統(tǒng)觀察了感病細胞中病毒粒子、內(nèi)含體及細胞器的變化特征,現(xiàn)將結(jié)果報道如下。1材料和方法1.1玉米病葉接種鑒定杭州市郊采集典型花葉癥狀的甘蔗(SaccharumsinensisRoxb.)病葉,轉(zhuǎn)接玉米(ZeamaysL.),獲得的病毒分離物SC-ZJ經(jīng)蔣軍喜等分子鑒定,毒源為SrMV。取接種SrMV的玉米病葉作為實驗材料。杭州市郊田間自然感染SCMV的玉米病葉實驗材料,由陳劍平等提供。1.2醛固定液中吸氣時間將上述兩種感病玉米葉片的葉肉組織切成1mm×3mm大小,置于0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.0)配制的2.5%戊二醛固定液中,抽氣至完全下沉,4℃冰箱過夜。經(jīng)緩沖液漂洗后,用相同緩沖液配制的1%四氧化鋨后固定1h,乙醇系列脫水,Spurr低粘度環(huán)氧樹脂包埋、聚合,在Reichart-JungULTRACUTE型超薄切片機上切片,切片收集于200目有膜載網(wǎng)上,經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色后,在日本JEOL公司的JEM-1200EX型透射電鏡下觀察拍照,加速電壓為60-80kV。2結(jié)果2.1和環(huán)形體的形態(tài)電鏡下觀察感染SrMV的玉米葉肉細胞,細胞質(zhì)中存在大量線狀病毒粒子,多數(shù)呈無規(guī)則散布(圖版Ⅰ之1),偶爾形成束狀排列的聚集體,周圍有一層單位膜包被(圖版Ⅰ之2),在嚴重病變的細胞中病毒粒子混雜于內(nèi)含體及瓦解的細胞器周圍。細胞質(zhì)中觀察到大量形態(tài)各異的內(nèi)含體,有風輪體(pinwheel)、束狀體(bundle)和環(huán)狀體(circular)(圖版Ⅰ之3)。風輪體和環(huán)狀體都是柱狀內(nèi)含體(cylindricalinclusion,CI)在橫切面上的形態(tài),組成內(nèi)含體的板狀物游離存在,形成風輪體,卷曲成閉合結(jié)構(gòu),則稱為環(huán)狀體或卷筒體(scroll)。束狀體是柱狀內(nèi)含體的縱切面形態(tài)。觀察到的風輪體一般具5~9個臂,呈輻射狀,臂展為200~400nm。環(huán)狀體的內(nèi)徑約100nm,外徑約130nm。風輪體和環(huán)狀體常集群出現(xiàn),少則幾個,多則幾十個(圖版Ⅰ之3)。束狀體兩端不對稱,多為一端平齊,另一端參差不齊;因切片的角度不同而長度和寬度都有所差異,長度一般介于500~1500nm之間,寬約150~300nm;束狀體平齊端常連在細胞膜上,垂直于細胞壁分布,有時還與胞間連絲相連(圖版Ⅰ之1,2)。除了柱狀內(nèi)含體外,還經(jīng)??梢杂^察到由高電子密度物質(zhì)組成的無定型內(nèi)含體成群分布在病變細胞的細胞質(zhì)內(nèi)(圖版Ⅰ之4)。SrMV侵染后,細胞質(zhì)和液泡中常觀察到有多層膜同心排列的髓鞘樣結(jié)構(gòu)(圖版Ⅰ之5,6),在一些細胞的液泡膜邊緣可看到一些特殊的多泡體結(jié)構(gòu)伸入液泡中,內(nèi)含眾多大小不等、形態(tài)各異的透明小泡(圖版Ⅰ之7)。感病細胞的葉綠體也有一定變化,基質(zhì)片層排列發(fā)生紊亂,甚至松散變形;淀粉粒異常增多,體積占據(jù)整個葉綠體的一半以上(圖版Ⅰ之8)。2.2scvm感染玉米細胞的細胞感染SCMV的玉米細胞中,多數(shù)線狀病毒粒子散布于細胞質(zhì)內(nèi),粒子濃度較高(圖版Ⅱ之9);在維管束篩管細胞中發(fā)現(xiàn)了排列成束狀的病毒粒子聚集體(圖版Ⅱ之10)。感病葉肉細胞中也觀察到了風輪體、束狀體以及環(huán)狀體,在篩管細胞中也發(fā)現(xiàn)了風輪體結(jié)構(gòu)(圖版Ⅱ之10)。風輪體很少集中出現(xiàn),一般具5~8個臂,臂展大約200~300nm。環(huán)狀體內(nèi)徑約100nm,厚度30nm左右。束狀體也為一端較齊,一段層次不齊,長500~1000nm左右,寬200~300nm,常與細胞壁垂直(圖版Ⅱ之11),但未發(fā)現(xiàn)與胞間連絲的連接現(xiàn)象。除了發(fā)現(xiàn)以上幾種內(nèi)含體外,細胞質(zhì)中還觀察到大量片層聚集體(laminatedaggregate)(圖版Ⅱ之11~13),這是感染SrMV的玉米細胞中不曾發(fā)現(xiàn)。片層聚集體由未卷曲的蛋白質(zhì)板疊合而成,可分為幾層,分散在細胞質(zhì)中,有的與風輪體核心結(jié)合,成為風輪體的臂,其長度介于1500~2500nm,厚度為幾十納米左右。與SrMV相似,SCMV侵染的玉米細胞質(zhì)中也產(chǎn)生了多泡體結(jié)構(gòu)(圖版Ⅱ之14),膜結(jié)構(gòu)明顯增生,產(chǎn)生了大量大小不等的次級小囊泡(圖版Ⅱ之15),小的囊泡可以逐步融合成大的液泡。葉綠體中嗜鋨顆粒的數(shù)量明顯增加(圖版Ⅱ之15)。沒有發(fā)現(xiàn)髓鞘結(jié)構(gòu)和無定型內(nèi)含體。2.3病毒粒子及葉綠體的超微結(jié)構(gòu)觀察在未受病毒侵染的健康玉米葉肉組織及維管束組織中,均未觀察到病毒粒子、無定型體、柱狀內(nèi)含體及其他異常結(jié)構(gòu),細胞超微結(jié)構(gòu)保持正常(圖版Ⅱ之16),葉綠體中含有少量嗜鋨顆粒。3玉米葉肉細胞的型與片層聚集體從以上實驗結(jié)果可以看出,SrMV和SCMV的細胞病變特征與Potyviridae病毒的典型細胞病理學效應相似,在Potyviridae病毒感染的組織細胞中,最顯著的病理特征就是產(chǎn)生柱狀內(nèi)含體。柱狀內(nèi)含體是由病毒基因組編碼的70kD蛋白質(zhì)組成的板狀物所構(gòu)成,不同的觀察面有不同的形態(tài),其橫切面為風輪狀體,從縱切面上看為束狀體。Potyviridae是植物病毒中最大的科,產(chǎn)生柱狀內(nèi)含體是所有成員共同的特征,Edwardson根據(jù)柱狀內(nèi)含體的形態(tài),將其分為4個類型:Ⅰ型具有風輪狀體和卷筒體,Ⅱ型具有臂伸展的風輪狀體和片層聚集體,Ⅲ型具有風輪狀體、卷筒體和片層聚集體,Ⅳ型具有風輪狀體、卷筒體和短而彎曲的片層聚集體。由本實驗結(jié)果可知,在感染SCMV的葉肉細胞中觀察到了風輪狀體、卷筒體以及片層聚集體,故其內(nèi)含體屬于Ⅲ型;而感染SrMV的玉米葉肉細胞僅發(fā)現(xiàn)風輪體和卷筒體,故屬于Ⅰ型。Lesemann(1992)研究了由SCMV劃分開的4種病毒SCMV、SrMV、玉米矮花葉病毒(MDMV)和約翰遜草花葉病毒(JGMV)的細胞病變特征,發(fā)現(xiàn)只有SCMV產(chǎn)生片層聚集體,本實驗的觀察結(jié)果與之相符。這樣,運用電鏡觀察內(nèi)含體形態(tài)就可以區(qū)分SrMV和SCMV,以作為除分子生物學、血清學之外的又一鑒別這兩種病毒的參考依據(jù)。在實驗中還觀察到SrMV感染的玉米葉細胞中存在著高電子密度的無定型體,與菜豆黃花葉病毒(BYMV)、木瓜環(huán)斑病毒(PRSV)引起的內(nèi)含體相似。現(xiàn)有研究表明,無定型體是由病毒編碼的52kD蛋白質(zhì)聚集體,為輔助成分/蛋白酶(HC-Pro),既有蛋白酶活性,又是蚜傳因子。但只有在少數(shù)Potyvirus病毒侵染的細胞中可以觀察到無定型體,在SCMV侵染的細胞中就未觀察到,其中原因不詳。感染SCMV的玉米細胞中,觀察到葉綠體上有大量的嗜鋨顆粒的累積,這與徐均煥等(1996)的研究結(jié)果相類似。嗜鋨顆粒是鋨酸與酚類物質(zhì)作用后所形成的物質(zhì),故嗜鋨顆粒的積累說明細胞中有較多酚類物質(zhì)的存在。關(guān)于嗜鋨顆粒積累的生物學含義有待進一步研究。在SrMV感染的玉米葉肉細胞中有的束狀體垂直于細胞壁,通過細胞膜與胞間連絲間接相連,這一結(jié)構(gòu)與Krass和Ford、以及Gardner的研究結(jié)果十分相似。胞間連絲是植物病毒進行細胞間轉(zhuǎn)運的通道,柱狀內(nèi)含體所處位置顯示其可能與病毒的胞間運動有關(guān)。Potyviridae病毒的胞間運動機理目前尚未完全搞清,分子生物學研究顯示,病毒基因組編碼的柱狀內(nèi)含體蛋白在病毒復制、短距離及長距離轉(zhuǎn)運過程中具有多重功能,同時病毒外殼蛋白在轉(zhuǎn)運中也起著重要作用。束狀體與胞間連絲的相連是否暗示了柱狀內(nèi)含體在結(jié)構(gòu)上與病毒轉(zhuǎn)運過程直接有關(guān)?Lawson(1971)和Andrews(1974)等曾發(fā)現(xiàn)與細胞膜相連的風輪狀內(nèi)含體常附著病毒粒子,并據(jù)此推測風輪狀內(nèi)含體在運輸病毒上起作用;Roberts(1998)運用免疫金標記電鏡技術(shù)研究了豌豆種傳花葉病毒(PSbMV)柱狀內(nèi)含體與胞間連

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