cd4+cd25+foxp3+調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)特性

cd4+cd25+foxp3+調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)特性

treg細(xì)胞在細(xì)胞免疫中的作用由于t反應(yīng)性細(xì)胞（treg）的存在，抑制了自身反應(yīng)性細(xì)胞的傳播，維護(hù)了身體環(huán)境的穩(wěn)定，預(yù)防和防止了自身免疫病的發(fā)生和發(fā)展，減少了身體過(guò)度免疫反應(yīng)引起的組織損傷。因此，近年來(lái)以treg細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞治療自身免疫病和過(guò)度反應(yīng)性炎癥引起了人們的興趣。體內(nèi)具有免疫調(diào)節(jié)的細(xì)胞主要包括：Th3、Tr1、CD8+CD28-細(xì)胞、NK2和Treg細(xì)胞等。表達(dá)FOXP3的專職調(diào)節(jié)T細(xì)胞是維持機(jī)體免疫平衡最重要的細(xì)胞。Treg細(xì)胞根據(jù)其產(chǎn)生部位以及生物學(xué)特性上的差異可分為2個(gè)亞群，分別稱為天然調(diào)節(jié)T細(xì)胞（naturallyoccurringTregs,nTreg）和誘導(dǎo)調(diào)節(jié)T細(xì)胞（inducibleTregs,iTreg）。nTreg在胸腺中自然發(fā)育成熟，iTreg在外周淋巴組織中或體外IL-2和TGF-β條件下，由傳統(tǒng)的CD4+FOXP3-細(xì)胞轉(zhuǎn)化為而來(lái)。1cd2和tgf-trag細(xì)胞是受誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞nTreg細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育受胸腺微環(huán)境的嚴(yán)格控制。Jordan等用自身抗原肽在胸腺中誘生出自身反應(yīng)性nTreg，并且發(fā)現(xiàn)，自身反應(yīng)性抗原肽-MHC-II復(fù)合物與TCR必須有較高的親和力才能成功誘生，低親和力抗原不能通過(guò)這樣的路徑激發(fā)nTreg細(xì)胞產(chǎn)生和發(fā)育。這一過(guò)程也需要樹突狀細(xì)胞提供很強(qiáng)的CD28共刺激信號(hào)，因?yàn)樵贑D28缺陷鼠中nTreg細(xì)胞顯著減少。自身反應(yīng)性抗原肽并不是在T細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中誘導(dǎo)nTreg細(xì)胞產(chǎn)生，是通過(guò)淋巴細(xì)胞陽(yáng)性選擇和陰性選擇而生成的一種特定的細(xì)胞品系，nTreg在胸腺中發(fā)育成熟，適應(yīng)胸腺細(xì)胞表達(dá)的自身抗原，所以，nTreg細(xì)胞本身就是一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞，在其成熟遷移至外周循環(huán)過(guò)程中，其表達(dá)FOXP3的生物學(xué)特性不受所處微環(huán)境的影響。iTreg細(xì)胞是成熟的na觙veCD4細(xì)胞在外周免疫器官中受微環(huán)境的影響，而逐漸表達(dá)CD25和FOXP3，因此，它是一種誘導(dǎo)型的、具有免疫調(diào)節(jié)的細(xì)胞。na觙veCD4細(xì)胞轉(zhuǎn)化為iTreg細(xì)胞，主要依賴外周淋巴器官中樹突狀細(xì)胞和所在的微環(huán)境。研究證實(shí)：用微量的抗原適度活化樹突狀細(xì)胞能夠誘導(dǎo)na觙veCD4細(xì)胞表達(dá)FOXP3，成為有免疫抑制作用的iTreg，添加TGF-β細(xì)胞增殖受到一定的抑制，但是轉(zhuǎn)化為表達(dá)FOXP3細(xì)胞的比率大幅上升，這些細(xì)胞與機(jī)體對(duì)外部抗原免疫耐受、腫瘤細(xì)胞的免疫逃避及過(guò)度的免疫應(yīng)答密切相關(guān)。體內(nèi)iTreg的誘導(dǎo)，不需要很強(qiáng)的TCR刺激，而是需要適度的抗原刺激，用B7中和抗體阻斷CD28的作用，提高共刺激分子CTLA-4和I-COS的作用，均有利于iTreg的發(fā)育。給DO11.10SCID鼠口服OVA抗原，5天以后在其腸系膜淋巴結(jié)發(fā)現(xiàn)大量的iTreg，對(duì)照組服用BAS，沒(méi)有見(jiàn)到iTreg增加的現(xiàn)象,說(shuō)明適度的抗原刺激能夠誘導(dǎo)iTreg的產(chǎn)生，這些iTreg細(xì)胞可以在腸道固有層中持續(xù)分化，以適應(yīng)微生物和食物對(duì)腸道的刺激，避免腸道對(duì)它們的免疫應(yīng)答。也有研究發(fā)現(xiàn)，用低劑量的CD28抗體（JJ316）能誘導(dǎo)體內(nèi)Treg大量產(chǎn)生，而且并不伴隨全身性淋巴細(xì)胞增生，提示Treg細(xì)胞對(duì)CD28抗體的刺激比較敏感。TGF-β在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)CD4+CD25-細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+細(xì)胞是必須的，但在nTreg的發(fā)育中卻存在爭(zhēng)議。采用敲除T細(xì)胞TGF-β受體方式的研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β不涉及胸腺中nTreg的發(fā)育。但有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，TGF-β1受體缺陷小鼠能出現(xiàn)嚴(yán)重的nTreg增生缺陷，因此認(rèn)為TGF-β與nTreg的發(fā)育相關(guān)。IL-2對(duì)iTreg細(xì)胞發(fā)育是必須的。Na觙veCD4細(xì)胞用anti-CD3和TGF-β刺激得到iTreg細(xì)胞，高濃度的IL-2能夠緩解TGF-b介導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制。用IL-2抗體和IL-2缺陷鼠T細(xì)胞證實(shí)，體外誘導(dǎo)FOXP3表達(dá)及其抑制活性的發(fā)揮，IL-2是必不可少的。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)HIV患者經(jīng)抗病毒和IL-2治療后，通常會(huì)有CD4細(xì)胞的初步恢復(fù)，但是其免疫缺陷的狀態(tài)并沒(méi)有相應(yīng)的恢復(fù)。在對(duì)長(zhǎng)期接受IL-2治療的HIV患者CD4細(xì)胞分析中發(fā)現(xiàn)，主要存在2個(gè)不同的細(xì)胞亞群，分別是CD4+CD25loCD127loFOXP3+和CD4+CD25hiCD127loFOXP3hi，其基因表達(dá)也類似健康人的Treg，這應(yīng)引起人們的注意，長(zhǎng)期使用IL-2可能導(dǎo)致Treg細(xì)胞增生，從而抑制機(jī)體的免疫狀態(tài)。目前，人們對(duì)體內(nèi)誘導(dǎo)iTreg所必需的微環(huán)境知之甚少，但已經(jīng)認(rèn)識(shí)到無(wú)論體內(nèi)還是體外，iTreg發(fā)育至少需要TCR刺激、IL-2和TGF-β的參與。2ntreg細(xì)胞的誘導(dǎo)表達(dá)通常外周血中Treg細(xì)胞數(shù)量很少，一般為CD4細(xì)胞的5-10%。為了達(dá)到治療所需的細(xì)胞數(shù)，必須體外擴(kuò)增足量的nTreg和/或iTreg細(xì)胞，尤其是因iTreg更容易獲得，且在免疫抑制功能上與nTreg接近，是目前研究的熱點(diǎn)。nTreg的分離通常有磁珠分離法和流式細(xì)胞儀分離法。體外擴(kuò)增nTreg首先需要得到高純度的nTreg細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)研究中多用流式細(xì)胞術(shù)分選出CD4+CD25+++的細(xì)胞，其細(xì)胞純度可達(dá)到97-99%。因?yàn)閚Treg沒(méi)有單一的標(biāo)識(shí)性的免疫標(biāo)志，磁珠法分離nTreg多采用多次分選法，通常先陰性選擇出CD4細(xì)胞，然后再選擇出CD25+細(xì)胞，該方法尚無(wú)法區(qū)分CD25+和CD25+++細(xì)胞群。目前，CD4+CD25+CD127dim/-的細(xì)胞也公認(rèn)為Treg的表面標(biāo)志，其中約90%的細(xì)胞表達(dá)FOXP3，因而陰性選擇出CD4+CD127dim/-細(xì)胞，再選擇出CD25+細(xì)胞也可認(rèn)為是nTreg細(xì)胞。通常認(rèn)為，在沒(méi)有受到抗原刺激的動(dòng)物體內(nèi)，即便是外周血中CD4+CD25+FOXP3+的調(diào)節(jié)T細(xì)胞也可認(rèn)為屬于nTreg細(xì)胞。nTreg細(xì)胞體外擴(kuò)增比較簡(jiǎn)單，可直接用1ng/mlPMA,200ng/ml離子霉素活化細(xì)胞，在100IU/ml重組IL-2的條件下，就可以使nTreg細(xì)胞得到有效的增殖。也有學(xué)者在高濃度的IL-2(2000IU/ml)的情況下，用anti-CD3/anti-CD28微球刺激人外周血分離的CD4+CD25+細(xì)胞，使得nTreg細(xì)胞擴(kuò)增200倍，這些細(xì)胞體外能夠抑制效應(yīng)T細(xì)胞增殖，并且表達(dá)nTreg的表型，如：CD62L、HLA-DR、CCR6和FOXP3。Hoffmann等用anti-CD3和anti-CD28抗體刺激細(xì)胞，在IL-2及CD32+L細(xì)胞共存的情況下，使人外周來(lái)源的CD4+CD25+細(xì)胞擴(kuò)增高達(dá)1萬(wàn)倍。從CD4+CD25-的細(xì)胞誘導(dǎo)iTreg細(xì)胞，則需要用anti-CD3/anti-CD28微球活化細(xì)胞，在10ng/mlTGF-β和100I-U/ml重組IL-2的條件下，可以得到增殖。盡管體內(nèi)也可以誘導(dǎo)出iTreg，但是目前還沒(méi)有有效的鑒定方法。體外誘導(dǎo)iTreg的優(yōu)勢(shì)是可誘導(dǎo)具有抗原特異性的iTreg細(xì)胞，回輸體內(nèi)后，能夠以抗原特異性的方式抑制相應(yīng)的免疫應(yīng)答。體外用TGF-β和IL-2結(jié)合TCR的刺激，能誘導(dǎo)CD4+CD25-細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+細(xì)胞，高表達(dá)FOXP3。Selvaraj等較為詳細(xì)的研究了在誘導(dǎo)過(guò)程中細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的變化，用CD3/CD28刺激CD4+FOXP3-細(xì)胞，加入TGF-β后2-3天，F(xiàn)OXP3就開(kāi)始明顯上調(diào)，90%以上的細(xì)胞發(fā)生了轉(zhuǎn)化。他們發(fā)現(xiàn)FOXP3表達(dá)需要嚴(yán)格的TCR刺激，但是不需要共刺激分子的作用，也不依賴細(xì)胞周期的改變。除去TGF-β4天后FOXP3大多丟失。大部分移植進(jìn)入鼠體內(nèi)的iTreg細(xì)胞，2天內(nèi)后FOXP3的表達(dá)開(kāi)始下調(diào)。這些FOXP3-的細(xì)胞主要分布在血液、脾、肺和肝內(nèi)。移植iTreg28天后，只能檢出很少的FOXP3-細(xì)胞，但是FOXP3+細(xì)胞依然能被檢出，他們主要定位于淋巴結(jié)和骨髓。所以，體外誘導(dǎo)的iTreg輸入體內(nèi)后，F(xiàn)OXP3表達(dá)是短暫的，并且是TGF-β依賴性的。在體內(nèi)輸入的iTreg中有一個(gè)亞群會(huì)長(zhǎng)期存在于體內(nèi)，提供一個(gè)長(zhǎng)久調(diào)節(jié)免疫活性的功能。3tsdr甲基化nTreg和iTreg均表達(dá)CD4+CD25+FOXP3+，目前還沒(méi)有公認(rèn)的區(qū)分兩者的方法。一般認(rèn)為，在沒(méi)有受到抗原刺激的情況下，CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞大多屬于nTreg，如果受到抗原刺激，則在機(jī)體內(nèi)nTreg和iTreg共存。nTreg表達(dá)CTLA-4(細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞抗原4)、GITR(糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體),CCR4(趨化因子受體)和CD62L,絕大多數(shù)nTreg都是已經(jīng)活化的CD4+T細(xì)胞(例如：鼠CD45RBlow，人表達(dá)CD45RO)。iTreg需要另外的、適度的抗原刺激，才能從na觙veCD4+CD25-細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái)，表達(dá)記憶細(xì)胞的某些標(biāo)志。體內(nèi)直接分選的nTreg，其FOXP3基因外顯子1上游進(jìn)化保守區(qū)(Tregcell-specificdemethylatedregion,TSDR)全部去甲基化，而體外誘導(dǎo)的iTreg盡管高表達(dá)FOXP3，但是其TSDR僅部分去甲基化，而CD4+CD25-T細(xì)胞TSDR全部甲基化。TSDR甲基化能抑制FOXP3表達(dá)，干擾Treg細(xì)胞的發(fā)育和免疫抑制功能作用的發(fā)揮，TSDR去甲基化是細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)FOXP3所必要的。所以，當(dāng)沒(méi)有TGF-β存在時(shí)，再次刺激iTreg，會(huì)喪失FOXP3的表達(dá)，而nTreg則無(wú)此現(xiàn)象。體外和體內(nèi)擴(kuò)增的iTregTSDR甲基化狀態(tài)也有顯著的差異，nTreg和體內(nèi)誘導(dǎo)的iTreg一樣，都能保持有效的TSDR未甲基化狀態(tài)，這與體外誘導(dǎo)的iTreg不一樣。Polansky報(bào)告了氮胞苷（azacytidine）對(duì)DNA甲基化的抑制作用，體內(nèi)用DEC-205誘導(dǎo)的iTreg可長(zhǎng)期存在表達(dá)FOXP3，顯示出有效的TSDR去甲基化狀態(tài)，可以保持3周。體外誘導(dǎo)的iTreg,STDR去甲基化狀態(tài)僅僅保持6天。FOXP3基因TSDR區(qū)的甲基化與否，控制了nTreg和iTreg表達(dá)FOXP3的狀態(tài)，TSDR甲基化使其表達(dá)FOXP3功能喪失，反之則高表達(dá)。nTreg和iTreg，特別是體外誘導(dǎo)的iTreg其TSDR甲基化狀態(tài)各不相同，從而表現(xiàn)出不同的特性。4rag-缺陷鼠的誘導(dǎo)使用相關(guān)細(xì)胞nTreg和iTreg都能夠保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，預(yù)防自身免疫病的發(fā)生，阻止自身免疫病的發(fā)展的作用是公認(rèn)的。TGF-β1和TGF-β受體基因敲除鼠發(fā)生嚴(yán)重的自身免疫病，盡管此時(shí)在胸腺中nTreg發(fā)育正常，但其在外周的免疫抑制功能受到很大地限制。由于TGF-β缺陷CD4+CD25-T細(xì)胞不能轉(zhuǎn)化為iTreg，因此，iTreg和nTreg在抑制免疫應(yīng)答中的相互作用開(kāi)始引起人們的注意。Haribhai等用結(jié)腸炎模型比較了nTreg、體外誘導(dǎo)的iTreg體內(nèi)誘導(dǎo)的iTreg的功能。轉(zhuǎn)移CD4+FOPX3-細(xì)胞進(jìn)入RAG-缺陷鼠誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型。如果na觙veT細(xì)胞因FOPX3基因突變而不能轉(zhuǎn)變?yōu)閕Treg，則疾病進(jìn)展很快。當(dāng)移植具有正常FOXP3基因鼠效應(yīng)T細(xì)胞之后，nTreg比體外誘導(dǎo)的iTreg能更好的控制疾病的發(fā)展。但是，重要的是：在FOXP3缺陷鼠中，必須iTreg和nTreg聯(lián)合應(yīng)用，才能對(duì)結(jié)腸炎模型鼠有保護(hù)作用（移植FOXP3缺陷鼠CD4細(xì)胞誘導(dǎo)的模型）。如果效應(yīng)細(xì)胞來(lái)自于FOXP3基因正常的鼠，則只用nTreg就能抑制疾病的進(jìn)程，主要是在鼠體內(nèi)，部分效應(yīng)細(xì)胞可轉(zhuǎn)變?yōu)閕Treg細(xì)胞。由此，在結(jié)腸炎模型中，如果要阻止疾病的進(jìn)展，nTreg和iTreg（體外誘導(dǎo)的或者體內(nèi)誘導(dǎo)的）兩種細(xì)胞都是必須的。在通常的實(shí)驗(yàn)研究中nTreg細(xì)胞實(shí)際上主要是nTreg，同時(shí)也包含了一部分體內(nèi)誘導(dǎo)的iTreg。只有nTreg與iTreg共存時(shí)（無(wú)論是體內(nèi)誘導(dǎo)還是體外誘導(dǎo)的iTreg），結(jié)腸炎模型鼠病情得到有效的控制，加之iTreg與nTreg基因表達(dá)圖譜顯著不同，提示iTreg與nTreg是兩類不同的細(xì)胞，兩者是相互協(xié)同來(lái)維持機(jī)體的免疫耐受。5外周血il-17+生物免疫細(xì)胞Treg細(xì)胞作為具有免疫抑制能力的細(xì)胞，盡管在動(dòng)物模型上顯示了良好的阻止自身免疫病、哮喘等疾病發(fā)生發(fā)展的作用。但是大多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)效果都是短期觀察，相對(duì)于人類慢性自身免疫病、哮喘和器官移植還有許多問(wèn)題沒(méi)有得到解決，如：nTreg在體內(nèi)有轉(zhuǎn)變?yōu)榉置贗L-17的可能，加重疾病