紅芪多糖的含量測定

紅芪多糖的含量測定

紅杏是豆科植物的多序巖黃巖的干燥根，與黃鼠尾相同的科，通常與黃鼠尾一起使用。自1985年版《中國藥典》開始,將紅芪單列為一種中藥。紅芪為甘肅省地道藥材,分布于我省宕昌、通渭、漳縣、岷縣、武都、渭源等地,具有補氣固表、利尿排毒、排膿、斂瘡生肌補氣等作用,可治療慢性腎炎蛋白尿、糖尿病等。多糖的含量測定常用的方法是苯酚-硫酸比色法、硫酸-蒽酮比色法等,這些方法穩(wěn)定性和選擇性都較差,且對儀器的靈敏度和操作者的實驗技能要求較高,因此影響實驗結果的準確性。目前未見文獻報道用HPLC法測定紅芪多糖的含量,本文用GC法測得紅芪藥材中紅芪多糖的組成為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖,用HPLC法、ELSD檢測器測定了紅芪藥材中紅芪多糖的含量,結果重現(xiàn)性好,穩(wěn)定,分析速度快,此方法的建立為紅芪多糖的進一步研究奠定了基礎。1儀器、試劑和儀器美國Waters2695高效液相色譜儀系列:在線脫氣機,四元泵,Millennum32工作站,2771自動進樣器,柱溫箱,ShodexsugarSP0810柱(日本昭和),Alltech蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD2000,美國),離心機(飛鴿牌),KQ3200DB超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),BUCHIR-200旋轉蒸發(fā)儀(瑞士),葡萄糖對照品(購自中國藥品生物制品檢定所),水為超純水,其他試劑均為分析純。2方法和結果2.1冷凍干燥取紅芪干燥根,加95%乙醇,加熱回流2h。藥渣干燥后加水煎煮3次,合并煎煮液并濃縮,將濃縮液分為兩份:一份加入乙醇使乙醇濃度為30%,靜置4h后離心,取沉淀冷凍干燥得多糖Ⅰ;上清液再加乙醇使乙醇濃度為50%,靜置離心,取沉淀冷凍干燥得多糖Ⅱ;上清液再加乙醇使乙醇濃度為70%,靜置離心,取沉淀冷凍干燥得多糖Ⅲ。另一份加入乙醇使乙醇濃度為70%,靜置4h后離心,取沉淀冷凍干燥得多糖Ⅳ,四種多糖樣品分別溶于蒸餾水中,各加入胃蛋白酶,37℃酶解,離心,棄去沉淀,上清液除蛋白,除色素得各四種純化紅芪多糖。2.2流動相純水ShodexsugarSP0810柱(300mm×8mm,5μm);流動相:純水;柱溫:90℃,流速0.85mL/min,載氣流速3.2L/min,漂移管溫度115℃。2.3對照溶液的制備精密稱取葡萄糖對照品15.4mg,加水溶解定容至10mL,作為對照品溶液。2.4供試品溶液的制備分別精密稱取紅芪多糖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ0.2g,分別加入2mol/LH2SO480mL,水浴100℃水解8h,水解液用NaOH調pH值至中性,加乙醇使乙醇濃度為80%,離心,取上清液,減壓回收乙醇并濃縮至干,殘渣加水溶解定容至10mL,作為供試品溶液。分別取對照品溶液、供試品溶液各30μL用2.2項色譜條件測定,色譜圖見圖1。2.5線性回歸分析取葡萄糖對照品溶液30、40、60、70、80μL分別進樣,按“2.2項色譜條件”測定峰面積,以峰面積為縱坐標,葡萄糖對照品進樣量為橫坐標(mL),進行線性回歸,回歸方程為:y=-5089610+242538.2xr=0.999(n=5),線性范圍為46.2~123.2μg。2.6精密度測試2.6.1內容度取對照品溶液40μL進樣,重復進樣5次,葡萄糖峰面積RSD為1.34%。2.6.2日度精密度取對照品溶液40μL進樣,每天進樣兩針,實驗3d。葡萄糖峰面積RSD為1.00%。2.7供試品溶液的制備取紅芪多糖Ⅱ樣品6份,同“2.4項供試品溶液的制備”處理樣品,作為供試品溶液。各進樣30μL,計算含量。多糖平均含量為24.23%,RSD為1.43%。2.8加樣樣品溶液的制備采用加樣回收法,分別精密稱取紅芪多糖IV,按下表量分別加入葡萄糖對照品,同“2.4項供試品溶液的制備”方法處理樣品,作為加樣樣品溶液。各進樣50μL,記錄色譜圖,計算回收率,結果見表1。2.9樣品含量的測量2.9.1紅治療紅治療高血壓的組分測定用水煎煮紅芪藥材、過濾、濃縮、醇沉得到紅芪粗多糖,再除蛋白、除色素得到純化多糖,然后將純化多糖水解制成糖腈乙酸酯衍生物,用GC法測得紅芪藥材中紅芪多糖的組成為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖,各單糖的百分比見表2。2.9.2供試品溶液的制備分別取紅芪多糖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ樣品各2份,同“2.4項供試品溶液的制備”處理樣品,作為供試品溶液。用0.45μm微孔濾膜過濾,分別取續(xù)濾液30μL,注入高效液相色譜儀,按上述色譜條件測定,計算樣品中紅芪多糖的含量,結果見表3。3水解溶劑與時間的選擇3.1由于實驗所用的shodex柱要求流動相為純水、乙醇(<20%)、乙腈(<20%),也可以用鹽。本實驗選用了不同的流動相,結果純水做流動相時峰形最好,柱壓穩(wěn)定,因此選用純水為流動相。3.2在整個實驗過程中,多糖的水解是很關鍵的一步,H2SO4的濃度不能過高,否則會引起糖的炭化,也會使色譜圖中出現(xiàn)較多的雜峰,但H2SO4的濃度太低,則多糖水解不完全,使分析結果偏低,因此選用2mol/L的H2SO4溶液水解8h。3.3在選定的水解條件下水解得到的葡萄糖最多。而其余幾種糖可能水解不完全,由于在組成中比例不大、部分又不是以單糖形式存在,所以在我們的實驗中無法檢測到,只能檢測到葡萄糖。由于GC法的樣品前處理較復雜,操作過程中誤差較大,只能作為其相對含量,而本HPLC法前處理簡單,回收率較好,因此我們結合了GC和HPLC兩種方法,以葡萄糖為對照,得到了樣品多糖的絕對含量。3.4我們用苯酚-硫