微生物蛋白質(zhì)組學

微生物蛋白質(zhì)組學1精選課件◆蛋白質(zhì)組學◆豬瘟病毒感染蛋白質(zhì)組學研究◆病毒感染蛋白質(zhì)組學研究進展2精選課件第一局部蛋白質(zhì)組學—Wilkins于1994年提出蛋白質(zhì)組概念?！鞍踪|(zhì)組比較公認的定義，基因組編碼的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組內(nèi)的蛋白質(zhì)數(shù)目等于基因組內(nèi)編碼蛋白質(zhì)的基因數(shù)目？在一個細胞中，并不是所有基因都是同時表達的，因此，一個細胞的蛋白質(zhì)組中蛋白質(zhì)數(shù)目少于基因組中基因的數(shù)目。另一方面，從基因可變剪切和蛋白質(zhì)修飾的角度看，蛋白質(zhì)數(shù)目又遠遠多于基因組中基因的數(shù)目。蛋白質(zhì)組的概念3精選課件蛋白質(zhì)組學的概念—蛋白質(zhì)組學是研究細胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)及其動態(tài)變化規(guī)律的科學，旨在闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達模式及其功能模式，其內(nèi)容包括鑒定蛋白質(zhì)的表達、存在方式〔修飾方式〕、結(jié)構(gòu)、功能和相互作用等。蛋白質(zhì)組學與傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)研究不同之處：蛋白質(zhì)組學研究是在生物體或細胞的整體蛋白質(zhì)水平上進行的，從一個機體或細胞的蛋白質(zhì)整體活動的角度來揭示和說明生命活動的根本規(guī)律蛋白質(zhì)組研究的意義蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者，是生命現(xiàn)象的直接表達者，對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究將直接說明生命在生理或病理條件下的變化機制。蛋白質(zhì)本身的存在方式和活動規(guī)律，如翻譯后修飾、蛋白質(zhì)間的相互作用以及蛋白質(zhì)構(gòu)象等問題仍需要直接對蛋白質(zhì)的研究來解決。4精選課件蛋白質(zhì)組學的特點與難點——蛋白質(zhì)組與基因組的區(qū)別與聯(lián)系■同一性與多樣性—基因組作為遺傳信息的載體，其最主要的特征就是同一性。對單細胞生物而言，不管在什么條件下，其基因組始終是不變的。對多細胞生物而言，同一個個體的基因組不管是在不同的發(fā)育階段或不同種類的細胞是同樣的?！鞍踪|(zhì)是生命活動的主要執(zhí)行者和表達者，對于不同類型的細胞或同一細胞在不同的活動狀態(tài)下，蛋白質(zhì)組的構(gòu)成是不一樣的。5精選課件■有限與無限—對基因組而言，不同物種的基因組，不管其大小，其核甘酸的數(shù)量是一定的、明確的?！獙Φ鞍踪|(zhì)組而言，一個細胞或生命體蛋白質(zhì)的種類究竟是多少那么很難確定。●細胞內(nèi)的大局部蛋白質(zhì)通常被進行過翻譯后修飾，如磷酸化、糖基化、?；取Ｐ揎椷^的蛋白質(zhì)具有其特定的物理化學性質(zhì)和生物學功能。對蛋白質(zhì)修飾的研究構(gòu)成了蛋白質(zhì)組學的一個分支：修飾蛋白質(zhì)組學?！袢绻f表達的蛋白質(zhì)的種類可以根據(jù)基因的數(shù)目來確定，那么修飾形成的蛋白質(zhì)種類只有依靠對蛋白質(zhì)的直接研究來決定，而這種研究是沒有止境的，因為蛋白質(zhì)的修飾與生命的活動密切相關(guān)。從這種意義上來講，對基因組核甘酸序列的測定是一種“有限〞的工作，而對蛋白質(zhì)組的蛋白質(zhì)種類確實定那么是一種“無限〞的工作。蛋白質(zhì)組學與基因組學的區(qū)別與聯(lián)系6精選課件■靜態(tài)與動態(tài)—一個個體的基因組自個體誕生到死亡，始終保持不變。而作為新陳代謝的主要執(zhí)行者的蛋白質(zhì)組，在個體的生命活動中卻總是變動不停。人們可以通過確定變化的蛋白質(zhì)來理解其功能。因此，蛋白質(zhì)研究的一個重要任務是，找出蛋白質(zhì)組里發(fā)生了變化的蛋白質(zhì)?！顒又械牡鞍踪|(zhì)可大致分為兩類：一類是比較穩(wěn)定的，如負責細胞各種結(jié)構(gòu)組成的蛋白質(zhì)。一類是隨細胞的活動和狀態(tài)發(fā)生量或質(zhì)變化的蛋白質(zhì)，如負責信號轉(zhuǎn)導或細胞活動調(diào)控的蛋白質(zhì)。在這種意義上，人們把以研究蛋白質(zhì)變化為主的蛋白質(zhì)組學稱為功能蛋白質(zhì)組學。其主要是比較在不同生長狀態(tài)下或病理狀態(tài)下的同一種細胞或組織的蛋白質(zhì)組內(nèi)的差異蛋白質(zhì)。與此相對應，測定一個細胞或組織含有的全部蛋白質(zhì)種類的研究就是通常所說的蛋白質(zhì)組學。蛋白質(zhì)組學與基因組學的區(qū)別與聯(lián)系7精選課件■時間與空間—DNA通常位于細胞核內(nèi)，且保持穩(wěn)定，因此測定基因組的DNA序列不受時空影響。對于轉(zhuǎn)錄的mRNA來說，時間是主要的參考因素，在發(fā)育的不同階段或細胞的不同活動時期，mRNA的表達是不一樣的。因此，在研究轉(zhuǎn)錄組或基因芯片時必須考慮到時間，但通常不需考慮空間的影響?！诘鞍踪|(zhì)組的研究中，不僅要考慮時間的因素，更要考慮空間的影響。

首先，不同的蛋白質(zhì)分布在細胞的不同部位，其功能與其空間定位密切相關(guān)。

其次，許多蛋白質(zhì)在細胞里不是靜止不動的，它們在細胞里常常通過在不同的亞細胞環(huán)境里的運動發(fā)揮作用。如細胞的信號傳導和轉(zhuǎn)錄調(diào)控也常常依賴于蛋白質(zhì)在空間位置的變化和運動。因此，蛋白質(zhì)組學中又派生了一個與空間緊密相關(guān)的新研究領(lǐng)域：亞細胞蛋白質(zhì)組學。這種亞細胞蛋白質(zhì)組可能是細胞器蛋白質(zhì)組，如高爾基體蛋白質(zhì)組，也可能比細胞器還要小的組分，如核膜。8精選課件■孤立行為與相互作用—基因組的基因表達的各種mRNA是彼此孤立的，互不干擾。—蛋白質(zhì)彼此間有著廣泛的相互作用，不存在不與其他蛋白質(zhì)發(fā)生作用的“孤立蛋白質(zhì)〞。蛋白質(zhì)的功能實現(xiàn)離不開蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)與其他生物大分子之間的相互作用。●蛋白質(zhì)組研究的一個主要內(nèi)容是研究大規(guī)模的蛋白質(zhì)的相互作用：相互作用組。●相互作用組研究可分為兩類：研究蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡：酵母雙雜交、噬菌體顯示和蛋白質(zhì)芯片技術(shù)研究蛋白質(zhì)復合體組成的分析，包括結(jié)構(gòu)型的蛋白質(zhì)復合體，如核孔復合體，這一類比較穩(wěn)定。另一種那么是功能型蛋白質(zhì)復合體，如負責轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄蛋白復合體或負責DNA復制的復制蛋白復合體，這類復合體只有在執(zhí)行功能時才聚合在一起，因此很不穩(wěn)定。9精選課件■單一手段與多種技術(shù)—基因組既無量的變化，也沒有質(zhì)的變化。在基因組研究中，DNA測序技術(shù)是一個最根本和最主要的工具?！鞍踪|(zhì)組研究技術(shù)的難度遠遠大于基因組研究技術(shù)，可簡單地分為兩大類，第一類是蛋白質(zhì)的別離技術(shù)，包括雙向電泳技術(shù)、細胞的分級別離技術(shù)、親和層析技術(shù)等蛋白質(zhì)組研究技術(shù)等。蛋白質(zhì)組別離面臨著蛋白的量和質(zhì)兩方面的難點。第二類是蛋白質(zhì)組的鑒定技術(shù)，其核心是質(zhì)譜技術(shù)。現(xiàn)有鑒定技術(shù)面臨的最大問題是，它們都依賴于的蛋白質(zhì)或基因的序列作為檢測的根底，通過比較來確定待測定的蛋白質(zhì)。對于在已有的數(shù)據(jù)庫中沒有記載的全新蛋白質(zhì)進行“從頭測定〞是一個很困難的任務?？傊鞍踪|(zhì)組對技術(shù)的依賴和要求遠遠超過基因組學。蛋白質(zhì)組學的開展是受技術(shù)限制的，也是受技術(shù)推動的。10精選課件■互補與互助—在后基因組時代，蛋白質(zhì)組研究和基因組研究依然是形影相隨的兩個重要領(lǐng)域。基因組與蛋白質(zhì)組之間既為互相補充又能互相幫助。—mRNA是介于基因和蛋白質(zhì)之間的中間產(chǎn)物。因為mRNA既是基因的產(chǎn)物，又比蛋白質(zhì)要容易分析，所以，研究mRNA的表達模式也是了解基因組和蛋白質(zhì)組的一個重要途徑。由此專門形成了一個新的研究領(lǐng)域：轉(zhuǎn)錄組。研究轉(zhuǎn)錄組的主要手段是基因芯片技術(shù)、SAGE〔基因表達序列分析〕技術(shù)?！鞍踪|(zhì)組的許多工作也離不開對基因組的研究，在蛋白質(zhì)組的相互作用研究中表現(xiàn)尤為突出。雙雜交技術(shù)、噬菌體顯示技術(shù)等就是以基因組數(shù)據(jù)和技術(shù)為根底的。11精選課件蛋白質(zhì)組學技術(shù)

蛋白質(zhì)別離蛋白質(zhì)鑒定生物信息學:蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫、蛋白質(zhì)功能數(shù)據(jù)庫等基于凝膠非凝膠雙向電泳〔2DE〕微流芯片多維色譜毛細管等電聚焦質(zhì)譜技術(shù)三大支柱12精選課件雙向電泳和差異凝膠電泳

■雙向電泳〔Twodimensionelctrophresis,2DE〕是根據(jù)不同蛋白質(zhì)等電點和分子量的不同利用第一向等電聚焦和第二向SDS電泳將蛋白質(zhì)混合物中的各種蛋白別離開。■差異凝膠電泳〔differentialgelelectrophoresis,DIGE〕是在2DE根底上建立的蛋白質(zhì)別離技術(shù)。該方法將待比較的兩個樣品蛋白質(zhì)分別用不同的熒光染料(Cy2、Cy3、Cy5)進行標記后，等量混合再進行雙向電泳。由于熒光染料的發(fā)光波長不同，可以在一塊凝膠上檢測兩個樣品，并通過蛋白點不同熒光信號間的比率確定蛋白量的差異。凝膠分離技術(shù)蛋白質(zhì)別離技術(shù)13精選課件色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

色譜與質(zhì)譜聯(lián)用就是將蛋白質(zhì)混合物通過液相色譜別離并收集樣品中的特定組分，然后再借助質(zhì)譜進行分析，獲得特定蛋白質(zhì)的分子量信息并對蛋白質(zhì)進行鑒定。目前，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用、反相液相色譜－離子交換色譜－反相液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜三維聯(lián)用等色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已廣泛用于蛋白質(zhì)組學研究。非凝膠分離技術(shù)14精選課件蛋白質(zhì)芯片與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

外表增強激光解析電離質(zhì)譜(surfaceenhancedlaserdesorptionionization-massspectrometry,SELDI-MS)就是將蛋白質(zhì)芯片與質(zhì)譜相結(jié)合的蛋白質(zhì)圖譜分析技術(shù)。該技術(shù)可直接將血清、尿液、組織提取物等蛋白質(zhì)混合物與不同化學外表〔疏水、親水、陽離子、陰離子、金屬離子螯合〕和生物外表〔抗原－抗體、受體－配體、DNA-蛋白質(zhì)〕的蛋白質(zhì)芯片相結(jié)合而將蛋白質(zhì)別離，然后用SELDI-MS對別離的蛋白質(zhì)進行鑒定。根據(jù)質(zhì)譜圖可得到蛋白的分子量及相對強度，分析不同樣品的差異蛋白。與2DE相比，該方法可以檢測到低豐度的蛋白質(zhì)、需時短并適于微量樣品的分析。非凝膠分離技術(shù)15精選課件16精選課件17精選課件生物質(zhì)譜技術(shù)與蛋白質(zhì)鑒定在蛋白質(zhì)組學研究流程中，蛋白質(zhì)的鑒定是最關(guān)鍵的一環(huán)。蛋白質(zhì)鑒定的主流技術(shù)就是生物質(zhì)譜技術(shù)。就技術(shù)而言，蛋白質(zhì)研究技術(shù)比核酸研究技術(shù)要相對復雜和困難得多，不僅氨基酸殘基種類遠遠多于核苷酸殘基，而且蛋白質(zhì)有著復雜的翻譯后修飾如磷酸化、糖基化等，這給別離分析帶來很多困難。20世紀80年代末在生物大分子領(lǐng)域得以廣泛應用的質(zhì)譜技術(shù)那么與Edman降解氨基酸測序使蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)得以說明、NMR的出現(xiàn)推進了對蛋白質(zhì)溶液構(gòu)象的解釋一樣，是蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域的里程碑。18精選課件對蛋白質(zhì)和多肽而言，質(zhì)譜技術(shù)就是要確定一個蛋白質(zhì)或多肽的分子質(zhì)量。分子質(zhì)量是一個蛋白質(zhì)、多肽或氨基酸最根本的特征，這種特征是專一的。不同的氨基酸組成、不同的氨基酸序列、不同的修飾方式、不同的蛋白質(zhì)間結(jié)合方式、不同的位點差異都可以在蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量上得以表達。對蛋白質(zhì)以及組成蛋白質(zhì)的多肽，氨基酸的分子質(zhì)量測定實際上就是對蛋白質(zhì)種類和性質(zhì)的鑒定。質(zhì)譜技術(shù)的根本原理是樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間質(zhì)荷比〔m/z〕的差異來別離并確定分子質(zhì)量。一臺質(zhì)譜儀一般由進樣裝置、離子化源、質(zhì)量分析器、離子檢測器和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)組成。其中，離子化源和質(zhì)量分析器是兩個中心部件，不同類型的質(zhì)譜儀主要就是根據(jù)這兩個部件命名的。19精選課件飛行時間質(zhì)譜〔TOFMS〕由離子源〔S〕引出極、漂移區(qū)〔D〕和檢測器組成。當離子在離子源內(nèi)形成后在離子源內(nèi)電場E的作用下進入無場漂移區(qū)。在理想狀態(tài)下，所有進入漂移區(qū)的離子具有相同的動能〔KE〕.測定離子在漂移區(qū)內(nèi)的飛行時間即可計算出它的質(zhì)荷比?；|(zhì)輔助激光解吸離子化是將樣品均勻包埋在固體基質(zhì)〔a－氰基－4－羥肉桂酸〕中，基質(zhì)吸收激光提供的能量而蒸發(fā)，攜帶局部樣品分子進入氣相，并將一局部能量傳遞給樣品分子使其離子化。基質(zhì)輔助激光解析離子化質(zhì)譜儀〔MALDI-TOF/TOF-MS〕檢測器加速電壓＋＋＋引出極漂移管D離子源DS飛行時間質(zhì)譜示意圖20精選課件21精選課件■

質(zhì)譜法結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索對多肽和蛋白質(zhì)進行鑒定這一方法的理論根底是認為每個蛋白質(zhì)經(jīng)過酶解成為長短不一的肽段后，同一時間獲得所有肽段分子質(zhì)量而形成一個肽段分子質(zhì)量圖譜，這一圖譜對蛋白質(zhì)應是專一而特異的，因此肽質(zhì)量指紋圖譜〔peptidemassfingerprinting,PMF〕。這一方法不需對圖進行人工解析，只需將實驗獲得的PMF與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)的理論PMF比對，就可以鑒定該蛋白質(zhì)。因此比傳統(tǒng)方法速度快、通量高，是最早用于大規(guī)模蛋白質(zhì)鑒定的質(zhì)譜方法，也是目前最簡便的蛋白質(zhì)鑒定方法之一。22精選課件

雙向電泳制備原那么：應使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)〔包括多數(shù)疏水性蛋白〕，且制備方法應具有可重現(xiàn)性。防止樣品在聚焦時發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學修飾〔如酶性或化學性降解等〕。完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性。雙向電泳分析中的樣品制備23精選課件制備原那么：雙向凝膠電泳第一向為等電聚焦〔IEF〕，根據(jù)蛋白質(zhì)等電點進行別離；第二向為SDS凝膠電泳〔SDS〕，根據(jù)蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量進行別離。所以，在樣品制備過程中，一切影響等電聚焦和凝膠電泳的因素都應該考慮在內(nèi)。有效的可重復的樣品制備是雙向電泳成功的關(guān)鍵。24精選課件可溶性樣品

固體組織樣品

細胞不同樣品的根本處理方法樣品的分級處理通過采用亞細胞分級、液相電泳和選擇性沉淀等方法對蛋白質(zhì)樣品進行分級處理，可降低樣品的復雜性并富集低豐度蛋白質(zhì)。當前最簡單有效的處理是采用分級抽提，按樣品溶解度不同進行別離。25精選課件樣品的溶解溶解的目標：1、樣品中非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)復合物和聚積體完全破壞，從而形成各個多肽的溶解液〔否那么樣品中結(jié)合牢固的蛋白復合物可能使2-DE中出現(xiàn)新的蛋白點，相應的表示單個多肽的點的強度會下降〕；2、溶解方法必須去除可能干擾2-DE別離的鹽、脂類、多糖和核酸等物質(zhì)；3、溶解方法要保證樣品在電泳過程中保持溶解狀態(tài)。是2-DE成功別離蛋白質(zhì)的最關(guān)鍵因素之一。26精選課件增加樣品溶解性的手段為獲得最正確的雙向電泳別離結(jié)果，樣品一般使用促溶劑、去污劑、復原劑、IPG緩沖液和兩性電解質(zhì)等將其變性并充分溶解。變性劑：尿素和硫尿是最常用的變性劑，其主要作用是改變氫鍵或次級鍵的結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域，使得蛋白質(zhì)變性并使蛋白酶失活。硫脲和尿素聯(lián)合使用，可大大增加蛋白質(zhì)的溶解性，特別是膜蛋白的溶解性。硫脲和尿素有效地破壞了疏水鍵，防止了聚集作用和二級結(jié)構(gòu)的形成，聚集作用和二級結(jié)構(gòu)的形成會改變蛋白質(zhì)的遷移性。27精選課件外表活性劑：經(jīng)過變性劑處理而暴露蛋白質(zhì)的疏水基團后，還常需至少一種外表活性劑來溶解疏水基團。外表活性劑的作用主要是破壞蛋白質(zhì)分子之間的疏水相互作用，提高蛋白質(zhì)的溶解性，防止等電聚焦時析出。原那么上去污劑應該是非離子型或者是兼性離子型，這樣才不會影響蛋白質(zhì)遷移到它們各自的等電點位置。離子型去污劑SDS不利于等電聚焦，但是SDS緩沖液可抑制蛋白質(zhì)被內(nèi)源性蛋白水解酶降解，并提高了蛋白質(zhì)的溶解性，特別是膜蛋白的溶解性，所以一般只用于樣品處理的初級階段，濃度不高于0.3％時，對等電聚焦不會產(chǎn)生太大影響。非離子型去污劑TritonX-100和NP-40以前應用較多，現(xiàn)多用兼性離子去污劑CHAPS，CHAPS比其他去污劑溶解疏水性氨基酸殘基的能力更強，其使用濃度一般在1％－2％。28精選課件復原劑：在變性劑和外表活性劑聯(lián)用條件下，加用復原劑可使已變性的蛋白質(zhì)展開更完全，溶解更徹底。復原劑主要用來斷裂蛋白質(zhì)分子中半胱氨酸殘基之間形成的二硫鍵，增加蛋白質(zhì)的溶解性。常用含自由巰基的DTT或-巰基乙醇，以及不帶電荷的三丁基膦〔TBP〕進行復原。其中DTT是使用比較廣泛的復原劑，在50mmol/L時能有效地復原大局部的二硫鍵。29精選課件起載體作用的兩性電解質(zhì)：即便在變性劑和外表活性劑存在的情況下，某些蛋白質(zhì)也需要在鹽離子的作用下才能保持其處于溶解狀態(tài)，否那么這些蛋白質(zhì)在其處于PI點時會發(fā)生沉淀。Carrierampholytes的作用在于捕獲樣品中的少量鹽分，從而保證蛋白質(zhì)的溶解性，吸附高濃度尿素在溶液中形成的氰酸鹽離子，離心時還有助于核酸的沉淀。應用時，兩性電解質(zhì)的濃度應小于0.2％〔w/v)。濃度過高會使IEF的速度降低。另外，為了保證實驗的精確性，在選擇不同pH范圍的IPG膠條時，也應使兩性電解質(zhì)的pH值與之相符合。30精選課件樣品液的準備標準液：ReagentAmount8Murea47mlof8.5stockor24gureain25mlH2O50mMDTTor2mMTBP385mgor500ulof200mMTBPstock4%CHAPS2g0.2%carrierampholytesSeenexttable0.0002%bromophenolblue100ulof0.1%stockddH2OTo50ml31精選課件IPGpHRangeBio-LyteAmpholyte(stock)rangeBio-LyteAmpholyte(stock)Conc.(w/v)SampleSolutionVolumePer5mlSampleSolutionVolumePer50ml3-103/1040%25

l250

l4-74/640%12.5

l125

l5/740%12.5

l125

l3-63/540%25

l250

l4/640%12.

l125

l5-85/840%25

l250

l7-107/940%12.5

l125

l8/1020%25

l250

lSuggestedBio-lyteampholytecompositionforIPGuse32精選課件ReagentAmount7Murea4.1mlof8.5stockor2.1gureain3mlH2O2MThiourea760mg2mMTBP50ulof200mMTBPstock4%CHAPS200mg0.2%carrierampholytesSeetable0.0002%bromophenolblue10ulof0.1%stockddH2OTo5mlMultiplechaotropicagentsolutionpreparation33精選課件ReagentAmount5Murea2.9mlof8.5stockor1.5gureain3mlH2O2MThiourea760mg2mMTBP50ulof200mMTBPstock2%CHAPS100mg2%SB3-10100mg0.2%carrierampholytesSeetable40mMTris24.2mg0.0002%bromophenolblue10ulof0.1%stockddH2OTo5mlMultiplesurfactantsolutionpreparation34精選課件樣品中核酸的去除對電泳的影響：增加樣品粘度、與蛋白質(zhì)形成復合物后會出現(xiàn)假象遷移和條紋。解決方法：用適量純的不含蛋白酶的核酸內(nèi)切酶進行降解，或是利用合成載體兩性電解質(zhì)〔SCA〕同核酸結(jié)合形成復合物的能力，再通過超速離心來去除復合物。35精選課件亞蛋白質(zhì)組樣品的制備用超離心技術(shù)別離出細胞器、質(zhì)膜和細胞核等成分，再用適當?shù)牡鞍踪|(zhì)溶解液進行溶解。其優(yōu)點是不僅大大減少樣品的復雜性，而且可對別離的蛋白質(zhì)進行亞細胞定位。但該法需要專業(yè)儀器，有時會出現(xiàn)假陽性。36精選課件亞蛋白質(zhì)組樣品的制備順序抽提法：根據(jù)細胞蛋白溶解性的差異，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液進行抽提的方法。第一步：用Tris堿溶液裂解細胞提取高溶解性蛋白；第二步：把未溶解的pellet用標準IEF樣品液溶解提取高疏水性蛋白；第三步：用含復合外表活性劑的蛋白溶解液，最后抽提前兩次抽提后不能溶解的膜蛋白約占整個樣品的11%〔W/W〕。37精選課件特殊樣品的制備低豐度蛋白的別離：盡管增加上樣量和提高總蛋白的溶解度能增加別離時的低豐度蛋白的量，但同時增加了高豐度蛋白的負荷，且造成蛋白的疊加效應而影響別離?，F(xiàn)常用預分級＋窄pH膠的微制備技術(shù)進行別離：即將總蛋白組分成蛋白質(zhì)組亞群，再用pH梯度小于2個pH單位的IPG膠進行窄pH范圍的別離。38精選課件強堿性蛋白質(zhì)〔如核糖體〕的處理：先將蛋白預處理以富集，再用特殊pH梯度的IPG膠條〔如pH3－12、4-12或10-12〕進行等電聚焦。其中窄范圍堿性IPG膠〔如pH10-12〕的挑戰(zhàn)是克服反向、陰極向陽極、電滲流和水平條紋模式，而寬范圍的堿性IPG膠〔如pH3-12、4-12〕等消除了窄范圍膠所需要的專門水化液。極端分子量的蛋白質(zhì)：小于8kD和大于200kD的蛋白在常規(guī)IPG-2D上不易看到，這可能是在Tris/glycine緩沖液中，樣品和游離的dodelcylsulfateions持續(xù)積累濃縮，與小分子量的蛋白質(zhì)發(fā)生對流混合，產(chǎn)生茸毛狀的或模糊的帶，從而降低小蛋白的分辨率；在膠底端，高濃度的十二磺酸使蛋白固定致染色困難。至于高分子量蛋白少的原因可能是在變性條件下，蛋白質(zhì)復合物變成了多肽，或者可能是大分子。39精選課件一維固相pH梯度等電聚焦〔IEFwithIPG〕：蛋白質(zhì)是帶有電荷的兩性生物大分子，其正負電荷的數(shù)量隨所處環(huán)境酸堿度的變化而變化。40精選課件一維固相pH梯度等電聚焦〔IEFwithIPG〕：41精選課件等電聚焦〔IEF〕電泳就是在凝膠中參加兩性電解質(zhì)，從而構(gòu)成從正極到負極pH逐漸增加的pH梯度，處在其中的蛋白分子在電場的作用下運動，最后各自停留在其等電點的位置上，測出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等電點。一維固相pH梯度等電聚焦〔IEFwithIPG〕：42精選課件43精選課件44精選課件一維固相pH梯度等電聚焦〔IEFwithIPG〕：IPG〔(ImmobilizedpHGradient,IPG)〕膠的材料是Immobilines，為擁有CH2=CH-CO-NH-R結(jié)構(gòu)的8種丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基團，它們構(gòu)成了分布在pH3~10不同值的緩沖體系。根據(jù)公布的配方計算后，將適宜的IPG試劑添加至混合物中用于凝膠聚合，在聚合中緩沖基團通過乙烯鍵共價聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通過這種方式生成的IPG不會發(fā)生電滲透作用，因而可以進行特別穩(wěn)定的IEF別離到達真正的平衡狀態(tài)。45精選課件IPG膠的重泡漲2-DE樣品重泡漲溶液重泡漲溶液：8M尿素2%NP-40或

CHAPS2%IPG緩沖液

(兩親性電解液)0.28%DTT微量

溴酚藍IPG膠條支架IPG

膠條定位泡脹的實質(zhì)：是讓樣品能完全以可溶性的形式進入IPG內(nèi)，從而能進行接下來的IEF。46精選課件蛋白載樣量影響IPG膠條對蛋白載樣量的因素包括：待分析的蛋白點的量應滿足隨后的質(zhì)譜分析待研究蛋白的豐度樣品的復雜度復雜度較高的樣品，為了盡可能的了解所包含的每種蛋白，需要反復實驗才能完成。如果將待檢樣品被富集以后那么更易分析。IPG膠條的pH范圍47精選課件IPG膠條的蛋白質(zhì)大約載樣量IPGStriplengthAnalyticalLoad(silverstaining)PreparativeLoad(Coomstaining)7cm10~100

g/125

l200~500ug/125

l11cm50~200

g/185

l250~1000ug/185

l17cm100~300

g/300

l1~3mg/300

l48精選課件?不同長度、多種窄pH范圍膠條可選，尤其是1個pH范圍?pH7-11NL堿性膠條IPGIEF中pH梯度的選擇49精選課件IPGIEF中pH梯度的選擇常用方法：先寬后窄，先線性后非線性，先短后長，預試驗確定。寬pH梯度用于：

全部蛋白(確定感興趣蛋白

的大致位置)窄pH梯度用于：

提高分辨率增加載樣能力以檢測、分析

更多蛋白50精選課件51精選課件52精選課件53精選課件54精選課件55精選課件18-20hIPG水化上樣56精選課件杯上樣&紙橋上樣杯上樣：有些情況下，需要在水化之后加樣，然后立即進行IEF電泳，例如，如果擔憂發(fā)生蛋白質(zhì)水解或其他蛋白質(zhì)修飾，樣本經(jīng)過過夜的水化過程就不適宜了。使用堿性ImmobilineDryStrip凝膠時，陽極樣本杯上樣可改善雙向電泳斑點圖像。紙橋上樣：紙橋上樣適合于非常大量的樣本和制備電泳，特別是采用堿性pH范圍時。57精選課件★IPGphor包括半導體溫控系統(tǒng)(20°C)和程序化電源(10000V)★可同時進行12根膠條的等電聚焦★聚焦效果以“Vh〞數(shù)控制，可提高重復性IEF電泳58精選課件59精選課件聚焦時間的優(yōu)化

理論上講，要獲得最好的圖譜質(zhì)量和重復性所需最正確時間是IEF別離到達穩(wěn)定態(tài)所需的時間。聚焦時間太短，會導致水平和垂直條紋的出現(xiàn)。過度聚焦雖然不會導致蛋白質(zhì)向陰極漂移，但會因為活性水轉(zhuǎn)運而導致過多水在IPG膠外表滲出〔電滲〕而造成蛋白圖譜變性，在膠條堿性端產(chǎn)生水平條紋以及蛋白喪失。最正確時間確實定需要根據(jù)不同蛋白樣品、上樣量、pH范圍和膠條長度通過經(jīng)驗來確定。60精選課件IEF的根本條件Stemp1Stemp2Stemp3totalvoltageTimeVolt-HoursRamp25020min－－－Linear400040002hr－－－－－－10,000V-hrLinearRapid5hr14,000V-hr7cmStemp1Stemp2Stemp3totaltotalStemp1Stemp2Stemp311cm17cm25025080001000010000800020min20min2.5hr2.5hr－－－－－－－－－－－－－－－－－－20,000V-hr40,000V-hr～30,000V-hr～50,000V-hr5.3hr7hrLinearLinearLinearLinearRapidRapid61精選課件兩維間的平衡

一維結(jié)束后可馬上進行二維電泳，也可保存在兩片塑料膜間于－80°保存數(shù)月。但在二維電泳前一定要進行膠條的平衡，以便于被別離的蛋白質(zhì)與SDS完整結(jié)合，從而在SDS是電泳能順利進行。建議方案是：用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)DTT、6mM尿素和30%甘油的50mMTris〔pH8.8〕緩沖液先平衡15min，再用5%(m/v)碘乙酰胺取代DTT后的上述緩沖液平衡15min。?第一步DTT平衡：使變性的非烷基化蛋白處于復原狀態(tài)(1x15min)1%DTT?第二步碘乙酰胺平衡：去除多余的DTT，防止拖尾(1x15min)2.5%iodoacetamide62精選課件二維SDS同普通SDS類似。但一般在垂直電泳系統(tǒng)中無需濃縮膠，因為在IPG膠條中蛋白質(zhì)區(qū)域已得到濃縮，可以認為非限制性IEF膠〔低濃度丙烯酰胺膠〕充當了濃縮膠。63精選課件二維SDS低熔點瓊脂糖64精選課件SealtheCassetteandFixtheIPGStripwithAgarose65精選課件InsertingtheCassette66精選課件67精選課件聚丙烯酰胺凝膠和轉(zhuǎn)印到膜上的蛋白質(zhì)的檢測理想顯色劑的7S平安〔safety〕：靈敏〔sensitivity〕：簡單〔simplicity〕：特異性〔specificity〕：快速〔speed〕：穩(wěn)定〔stability〕：兼容性〔synergy〕：68精選課件有機染料和銀染考染靈敏度為30~100ng，線性范圍是20倍；銀染的線性范圍是40倍，靈敏度是考染的100倍。膠體考馬斯亮藍染色技術(shù)可實現(xiàn)PAGE的無背景染色，其極限靈敏度為8~10ng，但這種染液會對蛋白質(zhì)進行修飾而影響質(zhì)譜分析的結(jié)果。胺基黑常用于轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯〔PVDF〕和/或硝酸纖維素膜上的蛋白質(zhì)的染色。銀染的缺點是：對某些種類的蛋白質(zhì)染色效果差，對其后的蛋白質(zhì)測序和質(zhì)譜分析造成影響。這兩種染色技術(shù)都可減少膠內(nèi)蛋白質(zhì)產(chǎn)量。69精選課件負染能專門提高PAGE膠上蛋白質(zhì)的回收率，但不能用于膜上染色。結(jié)果表現(xiàn)為膠面著色而蛋白質(zhì)點透明。速度快〔5~15min〕，蛋白質(zhì)的生物活性能保持：一旦用絡合劑如EDTA或Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)移緩沖液來絡合金屬離子就可進行提取來轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)。它主要適用于蛋白質(zhì)顯色、完整蛋白質(zhì)的膠上被動提取以及質(zhì)譜分析。該技術(shù)主要包括金屬鹽染料、鋅－咪唑染料等的使用。70精選課件膠體擴散染料主要用于高靈敏度檢出電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素和PVDF膜上的蛋白質(zhì)，不用于膠內(nèi)染色。最好的膠體金染色的靈敏度與PAGE膠內(nèi)的銀染類似。這種技術(shù)主要包括印度墨水染料、膠體金屬染料等。71精選課件有機熒光團染料包括共價結(jié)合和非共價結(jié)合的熒光團染料兩類。后者最為常用，其典型代表是已經(jīng)商品化的SYPRORed、Orange、Ruby等熒光染料。這三種染料可對SDS膠內(nèi)蛋白質(zhì)進行一步染色，約30~60min完成，靈敏度為2~10ng。染色后的凝膠用標準的實驗室300nm紫外透射儀進行照像保存，其線性范圍為3個數(shù)量級。這三種染料的電泳染色結(jié)果與在酵母中通過SAGE所獲得的基因表達水平的動態(tài)范圍相匹配。在Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)印緩沖液中染色后，蛋白質(zhì)可被轉(zhuǎn)印至膜上并進行免疫染色或Edman測序來鑒定蛋白質(zhì)。72精選課件金屬螯合染料這是一類與現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學研究相兼容的、相對較新的蛋白質(zhì)顯色試劑，其設計專門與常用微量化學表征過程兼容。它們不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化蛋白質(zhì)組學平臺〔包括自動化凝膠染色儀、圖像分析工作站、機器人剪切儀器、蛋白質(zhì)酶解工作站和質(zhì)譜儀等〕相結(jié)合。其中SYPRORuby也是一種基于釕的金屬發(fā)光染料。73精選課件凝膠的圖像處理分析和典型流程凝膠圖像的掃描：圖像加工：斑點檢測和定量：凝膠配比：數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)呈遞和解釋：2-DE數(shù)據(jù)庫的建立：74精選課件蛋白質(zhì)的膠內(nèi)酶切

包括感興趣蛋白點的挖取、含蛋白質(zhì)凝膠的脫色、膠內(nèi)蛋白質(zhì)的酶切等過程75精選課件實驗方法完整蛋白質(zhì)〔如凝膠別離或色譜純化蛋白質(zhì)〕肽混合物質(zhì)譜測定肽質(zhì)量〔MALDI-MS,ESI-MS)選擇肽段裂解PSD-MALDI-MS,ESI-MS/MS)計算方法蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫〔＋核酸序列翻譯數(shù)據(jù)庫〕肽質(zhì)量檢索未解析碎片離子檢索酶切質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)的策略76精選課件生物學問題的提出實驗模型的設計實驗組和對照組樣品的制備蛋白樣品的IEF和PAGE電泳別離圖像掃描和初步分析感興趣蛋白點的切取胰酶對脫色后蛋白質(zhì)的消化質(zhì)譜的多肽指紋圖、微測序分析質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學分析和比對新蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)其它實驗的進一步驗證蛋白信息的初步獲得77精選課件

孫金福

豬瘟病毒感染蛋白質(zhì)組學研究

第二局部78精選課件■

CSFV是豬瘟的病原，CSF是以出血性高熱、淋巴細胞減少和免疫抑制為主要特征的傳染病。近年來，CSF多呈溫和、慢性、非典型、持續(xù)感染特征，隱性感染母豬導致流產(chǎn)、死胎，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。

臨床病癥:發(fā)熱,白細胞減少,皮下、粘膜和內(nèi)臟器官出血CSFV感染蛋白質(zhì)組學79精選課件■

為了尋找CSFV感染、致病相關(guān)蛋白，揭示CSFV的致病機制,本研究用高通量蛋白質(zhì)組技術(shù)——2DE、2DDIGE和質(zhì)譜鑒定分析了感染CSFV體外細胞PK-15、體內(nèi)細胞PBMC和感染豬血清的蛋白質(zhì)組變化?！瞿壳?關(guān)于CSFV致病機制的研究多集中在病毒的自身毒力及宿主免疫反響方面，關(guān)于CSFV感染致病過程中宿主因素變化的報道較少。實際上，病毒的致病是病毒與宿主相互作用的結(jié)果，病毒的侵入會導致宿主細胞蛋白表達模式的改變，這種改變將影響宿主細胞的正常生理功能并決定病毒的致病進程和結(jié)果。CSFV感染蛋白質(zhì)組學80精選課件CSFV感染PK-15細胞蛋白質(zhì)組分析AB2081精選課件實驗方案2-DE

圖像分析MALDI-ToFMS/MS

差異表達蛋白的驗證差異蛋白功能注釋

裂解細胞PK-15cellsPK-15細胞

圖像分析

等電聚焦PAGE82精選課件1樣品制備與定量1.1樣品制備用豬瘟病毒石門株血毒〔1×105TCID50/0.1mL〕接種PK細胞，每瓶〔4×7mm〕細胞接種2×105TCID50。于接種病毒后48h，用細胞裂解液〔8M尿素、4％CHAPS、40mMTris、65mMDTT、10mM蛋白酶抑制劑〕裂解感染細胞，裂解液收集于1.5mL小離心管。圖1.1

簡接免疫熒光法檢測CSFV感染的PK-15細胞.(A)、(B)、(C)、(D)分別為感染后24h、36h、48h、60h的細胞樣品.CDcontrolAB1.2樣品定量各實驗組樣品經(jīng)超聲處理并離心〔20000g,15min〕后，用Bradfordassay法〔Bio-RadEttan2-DQuant試劑盒〕進行蛋白質(zhì)定量。83精選課件IPG(immobilizedpHgradient)膠條〔17cm,PH3-10,BIO-RAD)水化：適量水化液與150μg樣品混合，使總體積為350μL/strip,參加持膠槽，然后將IPG膠條放入持膠槽，防止有氣泡產(chǎn)生，放入膠條后，往膠槽加滿礦物油。在50V電壓條件下主動水化12h－16h。膠條水化后，在50μA/strip，20℃條件進行等電聚焦電泳?！膊煌碾娪鞠到y(tǒng)，上樣方法不同〕等電聚焦電泳程序：250V1h，500V1h，1000V1h，然后在1000V－10000V線性上升5h，10000V恒定8h，電壓時間積達80000VH。2雙向電泳〔2DE〕84精選課件■第一向電泳〔等點聚焦電泳〕StripsrehydrationIEF350μLrehydrationbuffercontainingofproteinsamples150μg

foreachstripe250V1h,500V1h,1000V1h,linearrampto8000Vover1h,then8000Vconstantforatotalof80000Vh.18-20h85精選課件第一向電泳后，IPGstrips置復原緩沖液中平衡15min，然后在烷基化緩沖液中平衡15min。復原緩沖液：烷基化緩沖液：50mMTris-HCl，pH8.850mMTris-HCl，pH8.86Murea,6Murea,4%w/vSDS4%w/vSDS65mMDTT53mMIodoacetamide〔碘乙酰胺〕30%glycerol30%glycerol痕量溴酚藍痕量溴酚藍膠條的平衡：86精選課件3凝膠染色SDS-PADE電泳：IPG膠條平衡后，轉(zhuǎn)移至SDS-PADE膠，進行第二向電泳。電泳程序設置為：5mA30min，10mA30min,15mA1h，20mA1h，25mA至結(jié)束。3.1硝酸銀染色1．固定45%乙醇+5%乙酸20-30min2．水洗2min×2-60min3．敏化0.02%Na2S2O31-2min4．水洗1min×25．染色0.1%AgNO34℃20-40min6．水洗1min×37．顯色40μl甲醛+2gNa2CO3100ml一般10min以內(nèi)8．停顯1%乙酸〔不可用于質(zhì)譜分析〕EDTA-Na2終止反響(3.65g/250mlddH2O)87精選課件3.2考馬斯亮藍染1固定液〔10%甲醇，7%乙酸〕固定2h2水洗3×10min3膠體蘭染色G250〔150－200ml〕3－4h或過夜4用去離子水脫色至背景消失。4圖像采集用掃描儀〔AmershamBiosciences,U9909H7L0〕掃描凝膠，采集圖像。88精選課件48h感染48h對照銀染分析膠圖像89精選課件5圖像分析用PDQuest軟件進行圖像分析的主要步驟：◆點的檢測〔spotdetection)◆建立匹配組〔machset〕◆建立復制組〔replicategroup〕◆建立分析組〔analysisset〕90精選課件5圖像分析91精選課件6表達差異蛋白質(zhì)點6.1軟件分析圖像分析顯示，各實驗組滿足T檢驗〔P<0.05〕，感染后48h表達差異1.5倍以上的蛋白點為：35個點

6.2人工比對對軟件分析給出的差異點進行人工校對。92精選課件7.1制備膠條件優(yōu)化樣品蛋白的丙酮沉淀：1按照蛋白樣品與預冷丙酮〔含20mmolDTT〕1:3比例參加預冷丙酮溶液2－20℃沉淀2h320000g離心15min，棄上清，倒置于濾紙上4參加原體積1/3裂解液，振蕩溶解5超聲處理〔超聲0.2秒，間隔2秒，15循環(huán)，20％功率〕6離心，20000g15min7取上清8定量7差異表達蛋白點的鑒定93精選課件考染制備膠圖像感染和對照混合樣品1.2mg621感染和對照混合樣品0.7mg62794精選課件

丙酮沉淀后對照，700mg720

丙酮沉淀后對照，＞700mg71195精選課件丙酮沉淀后感染>0.7mg730丙酮沉淀后感染0.7mg717上樣量不同96精選課件7.2制備膠切膠與膠內(nèi)酶解1切膠：用解剖刀將目的點切下，并將膠塊切成1mm3大小的膠粒，置EP管中。2脫色：參加脫色液100μL浸泡，振蕩20min，棄去溶液，重復1-2次洗至透明。3凍干：棄脫色液，將膠粒凍干。4酶解：參加15-20μL酶液〔0.01μg/μL〕，置于4℃放置30min，待酶液完全被吸收，棄多余酶液，補充酶解緩沖液〔25mMNH4HCO3〕15-20μL，使膠完全浸沒。37℃保溫15小時或過夜?！沧ⅲ簳r間不要太長〕5蛋白提取：吸出酶解液，移至新EP管，原管加提取液Ⅰ〔5%TFA〕100μL，40℃加熱水浴45min時，超聲3min左右，再水浴45min。吸出提取液與酶解液合并，然后向膠塊中參加提取液Ⅱ(50%乙腈，2.5%TFA)100μL，30℃保溫1小時，30min時，超聲3min左右，吸出提取液與前液合并，氮氣吹干乙腈后，冰凍枯燥。－20℃保存用于質(zhì)譜鑒定。97精選課件8質(zhì)譜鑒定樣品－基質(zhì)的準備與點靶：凍干的蛋白樣品用0.1%TFA溶解〔一般2.5μL左右〕，然后在靶上點樣。①Dried-Droplet法：飽和的基質(zhì)溶液與蛋白質(zhì)溶液混合〔5000:1〕，0.5-2μL混合液點到靶體上。②Thin-Layer法：均一的基質(zhì)層首先在靶體上形成，然后樣品加在其上。③先加樣品，再加基質(zhì)。樣品點0.8-1μL，可分屢次點樣。點完樣品后，點基質(zhì)0.6μL，一次點樣即可。98精選課件■全面分析了宿主細胞感染CSFV病毒后蛋白質(zhì)的整體表達模式。在對照和感染樣品中，每塊凝膠檢測到1300多個蛋白點。在病毒感染后48h，通過軟件分析，滿足T檢驗〔P<0.05〕、至少有1.5倍以上的差異表達的蛋白點共有35個。■在顯著差異表達的蛋白中，用串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOFMS/MS)共鑒定了21個蛋白點，其中上調(diào)表達蛋白16個，下調(diào)表達蛋白5個。根據(jù)差異表達蛋白的功能，，根據(jù)蛋白功能可以分為細胞骨架、細胞能量代謝、抗氧化應激、核酸復制/轉(zhuǎn)錄/翻譯、蛋白加工、信號傳導以及熱休克蛋白等7個類群。9PK-15細胞蛋白質(zhì)組分析結(jié)果99精選課件InfectionInfectioncontrolInfectioncontrolInfectioncontrolAnnexin2GAPDHcontrol

Resultof

Proteomeanalysis(PK-15cells)100精選課件■

感染與復制相關(guān)蛋白膜聯(lián)蛋白annexin2是一個鈣依賴的胞質(zhì)蛋白，能與胞膜結(jié)合。參與多種病毒的感染、復制、裝配、出芽與釋放。比方，annexin2介導巨細胞病毒的感染；在人上皮細胞，annexin2是呼吸道合胞病毒的受體;巨嗜細胞annexin2與HIV1糖蛋白Gag結(jié)合，并且annexin2下調(diào)表達可顯著抑制HIV復制。Annexin2在CSFV感染細胞中上調(diào)表達，說明其可能對CSFV感染和復制發(fā)揮著一定的作用。

差異表達蛋白的功能意義101精選課件不均一核糖核酸蛋白〔hnRNPs〕是一類核RNA結(jié)合蛋白，具有參與轉(zhuǎn)錄、mRNA運輸與剪接、mRNA穩(wěn)定性等功能。研究說明一些hnRNPs蛋白參與病毒的RNA合成和加工，比方，hnRNPA1參與丙型肝炎病毒〔HCV〕的復制，調(diào)節(jié)鼠肝炎病毒RNA合成，幾種hnRNPs蛋白還參與人獲得性免疫缺陷病毒〔HIV〕的RNA代謝和基因表達的調(diào)節(jié)?！?/p>

感染與復制相關(guān)蛋白

差異表達蛋白的功能意義102精選課件■

感染與復制相關(guān)蛋白

差異表達蛋白的功能意義翻譯延長因子1δ(EF-1δ)在感染樣品中顯著上調(diào)表達。真核翻譯延長因子在幾種病毒的復制和致病機制中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。如與WNV、登革熱4型病毒、HCV、HIV-1、BVDV等病毒的結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白相互作用，促進病毒的復制或抑制宿主細胞的蛋白表達。103精選課件■

細胞凋亡相關(guān)蛋白

差異表達蛋白的功能意義糖酵解酶磷酸甘油酸變位酶1〔PGAM1〕上調(diào)表達、三磷酸甘油醛脫氫酶〔GAPDH〕下調(diào)表達。除了能量代謝功能之外，PGAM的活性增強可抵抗細胞的氧化應激，促進細胞無限增殖；GAPDH是細胞凋亡的通用介導蛋白，與細胞凋亡有關(guān)，GAPDH上調(diào)表達會誘導細胞的凋亡?？寡趸瘧さ鞍住睵RDX6,thioredoxin-like〕上調(diào)表達,thioredoxin和PRDX6在細胞中過量表達能夠抵抗氧化應激，抑制細胞凋亡。以上凋亡相關(guān)蛋白的表達變化，抑制了細胞的凋亡，為病毒提供了持續(xù)繁殖的場所，實現(xiàn)了持續(xù)感染。104精選課件Peptidyl-prolylcis-transisomeraseA(cyclophilinA)playsanimportantroleindenovoproteinfoldingandinisomerizationofnativeproteinsinseveralcellularsystems.Inaddition,cyclophilinAinteractswithHCVRNAaswellastheviralpolymerase,andisanessentialcellularcofactorforHCVreplicationandinfection.46GrowingevidenceindicatesthattheimmunosuppressantcyclosporinA(CsA)-targetedcellularcyclophilincanstronglysuppressthereplicationofHCVinvitroorinvivo.BothHCVandCSFVaremembersoftheFlaviviridae,andhaveasimilargenomestructure;therefore,upregulationofcyclophilinAinCSFV-infectedsamplessuggeststhatcyclophilinAmayalsoplayacriticalroleinCSFVreplication.105精選課件PK-15細胞蛋白質(zhì)組分析106精選課件CSFV感染豬PBMC蛋白質(zhì)組分析裂解細胞

二維電泳

CSFV感染豬PBMC

分離外周血白細胞凋亡和T細胞亞群動力學檢測107精選課件外周血白細胞凋亡、CD4+和CD8+T淋巴細胞亞群變化動力學

攻毒后豬外周血白細胞總數(shù)顯著減少，白細胞凋亡顯著高于對照組，CD4+和CD8+T淋巴細胞亞群急劇下降，說明CSFV感染誘導細胞凋亡是免疫細胞減少和免疫抑制的主要原因。108精選課件

PBMC蛋白質(zhì)組分析結(jié)果感染的PBMC樣品中共有73個差異表達蛋白點，質(zhì)譜鑒定了其中51個蛋白點，屬于34種特定蛋白。根據(jù)差異表達蛋白的功能可以分為細胞骨架、能量代謝、抗應激蛋白、核酸復制/轉(zhuǎn)錄/翻譯、蛋白加工等5個功能類群。

109精選課件

PBMC蛋白質(zhì)組分析結(jié)果Westernbloting比較分析cofilin和annexinA1在CSFV感染豬PBMC和對照樣品的表達水平110精選課件

PBMC蛋白質(zhì)組分析結(jié)果■細胞骨架紊亂多種細胞骨架蛋白包括肌動蛋白、膜突蛋白、粘著斑蛋白、膜聯(lián)蛋白A1、踝蛋白等蛋白的表達發(fā)生了變化〔上調(diào)或下調(diào)〕。共有7個不同的蛋白點鑒定為β肌動蛋白或肌動蛋白亞型，4個不同的蛋白點鑒定為膜聯(lián)蛋白annexinA1。具有不同分子量、等電點的蛋白點被鑒定為同一種蛋白，可能是CSFV感染誘導了宿主細胞骨架蛋白的解聚、降解或不同程度的翻譯后修飾，導致細胞骨架的紊亂、崩解。肌動蛋白骨架完整性的喪失與細胞凋亡有著密切的聯(lián)系。肌動蛋白骨架紊亂能夠激活細胞凋亡蛋白酶-3(caspase-3)，進而誘導細胞的凋亡。

111精選課件

PBMC蛋白質(zhì)組分析結(jié)果■感染與復制相關(guān)蛋白膜突蛋白是細胞骨架重塑相關(guān)信號的轉(zhuǎn)導蛋白，能夠調(diào)節(jié)穩(wěn)定微管的形成，在感染樣品顯著上調(diào)表達。在HIV-1感染的T細胞系CEM和H9細胞中，膜突蛋白上調(diào)表達，與HIV囊膜糖蛋白gp120結(jié)合，這種結(jié)合可能在病毒的攝入、裝配和出芽過程中發(fā)揮著重要的作用。與膜輔蛋白CD46相互結(jié)合形成麻疹病毒（meslesvirus,MV）的受體復合物，促進細胞對MV的攝入。翻譯延長因子1α(EF-1α)在感染樣品中顯著上調(diào)表達，與體外PK-15相似。112精選課件

PBMC蛋白質(zhì)組分析結(jié)果■細胞凋亡相關(guān)蛋白粘著斑蛋白參與調(diào)節(jié)與細胞生存和凋亡有關(guān)的細胞信號途徑，有研究顯示在凋亡細胞中粘著斑蛋白上調(diào)表達，而在高度惡化和轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞中粘著斑蛋白缺失或顯著下調(diào)表達。粘著斑蛋白在感染樣品中上調(diào)表達，顯示CSFV誘導了PBMC的凋亡。GAPDH上調(diào)表達8倍，而在體外PK-15細胞顯著下調(diào)表達。抗氧化物酶Prx-1下調(diào)表達，Prx-1參與信號調(diào)節(jié)激酶1（signal-regulatingkinase1,ASK1)信號介導的細胞凋亡途徑，并在該凋亡途徑中發(fā)揮著抑制凋亡的作用。

113精選課件

PBMC蛋白質(zhì)組分析結(jié)果■免疫相關(guān)分子血小板反應素1（Thrombospondin1，TSP-1)

，除參與凝血機制外，還具有免疫調(diào)節(jié)功能，比如，TSP-1調(diào)節(jié)T細胞行為并參與炎性T細胞的激活和克隆增殖。有證據(jù)表明，敲除TSP-1的轉(zhuǎn)基因小鼠對細菌性肺臟感染較敏感，顯示了TSP-1對宿主免疫反應的作用。TSP-1顯著下調(diào)，可能干擾T細胞的免疫功能?？寡趸鞍椎纳险{(diào)表達有助于增強CD8(+)T細胞的抗病毒活性，在HIV感染活化的CD8(+)T細胞中，過氧化物氧化還原蛋白家族成員NKEF-A和NKEF-B上調(diào)表達。本研究中，Prx-1顯著下調(diào)表達，可能會影響CD8(+)T細胞的抗病毒活性。

114精選課件CSFV感染豬血清差異蛋白質(zhì)組分析2D-DIGECSFV感染豬血清分離

血清標記

去除高豐度蛋白115精選課件

血清差異蛋白質(zhì)組分析

由于血清/血漿樣本易于采集，并且含有細胞和組織分泌的數(shù)千種蛋白，血清/血漿中蛋白成分的動力學變化反映著機體細胞、組織的病理生理狀態(tài)，因此血清/血漿是最有價值的尋找蛋白標記的樣品。在人的腫瘤、病毒性疾病的血清蛋白質(zhì)組研究中發(fā)現(xiàn)了一系列的疾病相關(guān)蛋白標記，建立了一些新的診斷方法。

116精選課件Cy2(紅色)標記混合內(nèi)標對照樣品；Cy3(藍色)標記感染血清樣品；Cy5(綠色)標記對照血清樣品。白色的點說明該蛋白在三種樣品的含量是相等的，紫色的點說明該蛋白在感染血清中上調(diào)表達，綠色的點說明該蛋白在感染血清中下調(diào)表達。

血清差異蛋白質(zhì)組分析結(jié)果117精選課件

血清差異蛋白質(zhì)組分析結(jié)果

發(fā)現(xiàn)了17個差異表達蛋白點，用質(zhì)譜鑒定了14個差異表達蛋白。這些差異表達的血清蛋白反映了CSFV感染豬組織、細胞的生理狀態(tài)的變化，進一步的評價分析將有可能發(fā)現(xiàn)與致病機制相關(guān)的信息或新型診斷標記。

118精選課件

血清差異蛋白質(zhì)組分析結(jié)果接聯(lián)球蛋白屬于急性期蛋白，可抑制炎性反響造成的損傷。在急性和慢性炎癥、病毒感染以及腫瘤等疾病中，血清接聯(lián)球蛋白的水平會提高。除此之外，接聯(lián)球蛋白還具有刺激血管生成和組織修復的生物功能。CSFV感染可造成血管內(nèi)皮系統(tǒng)的損傷，接聯(lián)球蛋白水平在感染血清中降低，可能不利于炎癥損傷的控制和血管內(nèi)皮系統(tǒng)損傷的修復，進而導致宿主皮下、內(nèi)臟器官粘膜出血。119精選課件

血清差異蛋白質(zhì)組分析結(jié)果凝血酶抑制因子亞型2的水平顯著下調(diào)，凝血酶是一個絲氨酸蛋白酶，在凝血級聯(lián)反響和止血過程中發(fā)揮著核心的作用。此外，凝血酶控制內(nèi)皮組織對損傷的增生、修補反響，促進促炎癥反響和促凝血內(nèi)皮系統(tǒng)反響。在CSFV感染豬的血清中，凝血酶抑制因子亞型2的水平顯著下調(diào)，可能誘導了凝血機制的紊亂，造成毛細血管彌漫性凝血。120精選課件

血清差異蛋白質(zhì)組分析結(jié)果載脂蛋白AI是高密度脂蛋白的主要載脂蛋白，由肝臟和腸道產(chǎn)生，在膽固醇的逆行轉(zhuǎn)運中具有重要的作用，還具有抗炎癥、抗氧化劑、修復人的內(nèi)皮系統(tǒng)功能障礙的作用。apoAI的水平顯著下調(diào)，可能不利于炎癥反響的控制和血管內(nèi)皮系統(tǒng)的功能修復。121精選課件

血清差異蛋白質(zhì)組分析結(jié)果與免疫有關(guān)的補體C4的亞基C4a、免疫球蛋白γ鏈兩種蛋白在CSFV感染血清中下調(diào)表達。補體系統(tǒng)失調(diào)與凝血系統(tǒng)的功能障礙等疾病有關(guān)。補體成分是炎癥反響的重要調(diào)節(jié)因子，并促進免疫反響的調(diào)節(jié)C4是補體經(jīng)典途徑的主要成分，感染血清C4a的下調(diào)，可能對補體系統(tǒng)的激活和機體的免疫反響以及凝血系統(tǒng)造成不良影響。

差異表達蛋白中的一些蛋白如接聯(lián)珠蛋白、載脂蛋白AI

及C4a被鑒定為其它疾病的生物標記，這些差異表達蛋白作為CSFV感染生物標記的潛在可能性還需進一步的評估。122精選課件■用2-DE、2DDIGE和質(zhì)譜鑒定等高通量蛋白質(zhì)組學技術(shù)對CSFV感染蛋白質(zhì)組進行了系統(tǒng)分析，獲得了迄今最為完善的CSFV感染體內(nèi)外宿主細胞、宿主血清差異表達蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)。■鑒定了一些可能的CSFV感染、復制與致病相關(guān)宿主蛋白和可能的抑制和誘導宿主細胞凋亡的細胞途徑。為CSFV致病機制和新型預防、治療靶標以及診斷標記的進一步研究奠定了根底，提供了研究素材。

結(jié)論123精選課件病毒蛋白質(zhì)組學研究進展病毒病原生態(tài)與分子流行病實驗室第三局部124精選課件■

病毒粒子蛋白質(zhì)組■

病毒感染誘導宿主細胞的蛋白質(zhì)組變化■

病毒感染宿主血清蛋白質(zhì)組125精選課件1

病毒粒子蛋白質(zhì)組研究◆

全面了解病毒粒子的蛋白質(zhì)組成是研究病毒生物學功能以及特定病毒蛋白與宿主細胞蛋白相互作用的前提?！粲行┎《玖Ｗ又泻蟹遣《揪幋a的宿主細胞蛋白，這些宿主蛋白反映了病毒在細胞不同的細胞器或細胞亞單位進行復制、裝配和釋放的可能過程；◆有些病毒粒子中的宿主細胞蛋白，在病毒的生命循環(huán)中發(fā)揮著重要作用，又非病毒基因組編碼，沒有突變的壓力，可以作為良好的抗病毒治療候選靶標。如HIV-1病毒粒子中的宿主細胞蛋白CyclophilinA(CypA)，在病毒的復制中發(fā)揮著必不可少的作用。

126精選課件病毒粒子蛋白質(zhì)組分析技術(shù)路線127精選課件以痘苗病毒為例，有多個小組用不同方法分析了其蛋白質(zhì)組成。早在1996年，Jensen等用2DE和MALDI-TOF-MS分析了痘苗病毒的蛋白質(zhì)組，共鑒定13個病毒編碼蛋白，5個細胞蛋白。Chung等〔2006〕用LC/MS/MS技術(shù)鑒定了痘苗病毒粒子〔IMV〕包括結(jié)構(gòu)蛋白、酶和轉(zhuǎn)錄因子等在內(nèi)的75個病毒蛋白和23個宿主細胞蛋白，病毒蛋白中有10種蛋白是新發(fā)現(xiàn)的病毒蛋白，其中7個蛋白(E6R,G3L,L3L,A6L,A15L,A31R,andC6L)是以前推測的ORFs產(chǎn)物，3個蛋白(K4L,G9R,A16L)的功能和定位是以前所未知的。Yoder等〔2006〕用五種不同組合的方法鑒定了痘苗病毒粒子63個病毒編碼蛋白，發(fā)現(xiàn)了2個由以前未知的閱讀框編碼蛋白〔E6R和L3L〕。128精選課件

上述研究用高通量的蛋白質(zhì)組學方法鑒定了許多以前未知的病毒編碼蛋白或未注釋的ORFs的產(chǎn)物以及宿主細胞蛋白。由結(jié)果可知，不同的蛋白質(zhì)組方法研究同一種病毒粒子蛋白質(zhì)組的結(jié)果不盡相同，說明不同的方法具有互補性。迄今為止，已報道了包括痘苗病毒、腺病毒、人巨細胞病毒、鼠巨細胞病毒、HIV、SARSCoV等11種病毒的蛋白質(zhì)組研究。129精選課件病毒成功實現(xiàn)對宿主細胞的感染并在細胞內(nèi)復制需要克服多重障礙，一方面要克服細胞對病毒感染產(chǎn)生的各種免疫防衛(wèi)反響；另一方面要阻斷或影響宿主細胞的正常循環(huán)機制，利用宿主細胞的物質(zhì)和能量合成病毒自身物質(zhì)，以實現(xiàn)病毒的復制。因此，病毒感染必然會導致宿主細胞的蛋白質(zhì)組變化，這種變化又反映了病毒介導的宿主細胞生理功能的變化，反映了病毒的感染及其致病的進程。所以，進行病毒感染宿主細胞蛋白質(zhì)組的研究是揭示病毒與宿主細胞相互作用機制、發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標和治療方法的重要手段。2病毒感染誘導宿主細胞的蛋白質(zhì)組變化130精選課件2.1比較蛋白質(zhì)組學技術(shù)路線131精選課件◆二維差異凝膠電泳〔2Ddifferentialgelelectrophoresis,2DDIGE〕別離技術(shù)克服了傳統(tǒng)2DE存在的膠與膠之間的差異以及傳統(tǒng)的銀染等染色方法線性范圍窄等缺陷，提高了結(jié)果的重復性、準確性，因此，目前應用較多?！舫Ｓ玫臉擞浂抠|(zhì)譜技術(shù)包括體外標記ICAT(isotope-codedaffinitytag)和體內(nèi)標記SILAC[5](stableisotopelabelingbyaminoacidsincellculture)等技術(shù)，ICAT技術(shù)是用輕、重兩種試劑與蛋白質(zhì)分子的半胱氨酸殘基的－SH基團反響，標記不同蛋白樣品?！鬝ILAC技術(shù)主要是在培養(yǎng)細胞的介質(zhì)中參加用穩(wěn)定同位素標記的某一種必需氨基酸，在細胞生長過程中摻入標記的氨基酸，實現(xiàn)對不同樣品蛋白質(zhì)的標記。2.2蛋白質(zhì)組學常用技術(shù)的特點比較132精選課件◆這些技術(shù)方法各有其優(yōu)勢和局限性，聯(lián)合使用可實現(xiàn)優(yōu)勢互補。與ICAT相比，SILAC技術(shù)省去了標記化學反響和別離純化等繁瑣步驟，但只能用于體外培養(yǎng)細胞，不能用于組織來源的蛋白質(zhì)樣品分析，ICAT那么不能檢測沒有半胱氨基酸殘基的蛋白質(zhì)分子。◆2DDIGE在檢測極端分子量和等電點以及低豐度蛋白方面存在局限性，但具有能夠檢測翻譯后修飾的不同蛋白亞型的優(yōu)勢。；◆ICAT和SILAC兩種技術(shù)雖在檢測低豐度蛋白方面有強大優(yōu)勢，但不能檢測蛋白質(zhì)的翻譯后修飾亞型。◆為了簡化上述化學標記定量方法的繁瑣性和消除因標記效率等因素造成的定量誤差，建立了無需樣品標記〔label-free〕的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜定量蛋白質(zhì)組新方法，并在實踐中陸續(xù)得到應用。2.2蛋白質(zhì)組學常用技術(shù)的特點比較133精選課件2.3在蛋白質(zhì)水平全面揭示宿主細胞的蛋白表達模式

◆Mannová等用2DE、SILAC兩種方法分析了HCV感染細胞Huh7的脂筏〔lipidrafts〕蛋白質(zhì)組變化。兩種方法共鑒定了189個差異表達蛋白，這些蛋白大多數(shù)與囊泡和蛋白運輸以及細胞信號有關(guān)。用siRNA抑制上調(diào)表達蛋白RhoA、Rab9A、syntaxin7、Bax和Cdc42的表達，分析其對HCV復制的影響。結(jié)果顯示，抑制Cdc42和RhoA表達會提高HCV的復制，而抑制突觸融合蛋白7〔syntaxin7〕的表達會導致HCV復制的降低。抑制Rab9A和Bax的表達，對HCV復制沒有影響。134精選課件2.3在蛋白質(zhì)水平全面揭示宿主細胞的蛋白表達模式

◆Jiang等在SARS冠狀病毒〔SARS-CoV〕感染的veroE6細胞系鑒定了186個顯著差異表達蛋白。西尼羅河病毒〔WNV〕感染原代神經(jīng)元細胞，誘導55個蛋白表達水平發(fā)生變化，其中的9種鑒定為凋亡相關(guān)蛋白。人獲得性免疫缺陷病毒1型〔HIV-Ⅰ〕LAI株感染CD4+CEMx174細胞系，在病毒產(chǎn)量頂峰期，有687種蛋白的表達豐度發(fā)生變化，這些蛋白多數(shù)參與泛素化、核質(zhì)運輸、細胞循環(huán)等重要生命循環(huán)和代謝通路。135精選課件◆HIV-1的感染可致CD4＋T細胞數(shù)量減少，導致免疫缺陷綜合征〔AIDS〕。但矛盾的是CD4＋T細胞又是HIV-1病毒的主要繁殖場所，并且有一小局部CD4＋T細胞長期存活，持續(xù)生產(chǎn)完整的病毒粒子，這種持續(xù)感染機制尚不清楚?！舻鞍踪|(zhì)組分析說明，HIV-1Tat蛋白使T細胞的7種細胞骨架蛋白或與細胞骨架重組相關(guān)的蛋白下調(diào)表達，這些蛋白的下調(diào)表達使宿主細胞防止了細胞骨架的重組，保持了細胞的完整，從而抑制了細胞凋亡，使HIV感染細胞成為長期的和持續(xù)的病毒粒子生產(chǎn)場所，實現(xiàn)了HIV的持續(xù)性感染。2.4.1

HIV病毒持續(xù)感染機制

2.4揭示病毒的分子致病機制

136精選課件關(guān)于感染野生型狂犬病毒〔RV〕和弱毒RV小鼠的蛋白質(zhì)組分析顯示與離子平衡有關(guān)的蛋白H+ATP酶和Na+/K+ATP酶上調(diào)表達，而Ca2+ATP酶下調(diào)表達，參與突觸泡與突出前膜對接或融合的相關(guān)蛋白〔alpha-synaptosome-associatedprotein(SNAP),tripartitemotif-containing9(TRIM9),syntaxin,andpallidin〕下調(diào)表達，這些蛋白的下調(diào)表達，可能導致了神經(jīng)機能障礙。另外，致弱的RV感染介導凋亡相關(guān)蛋白的上調(diào)表達，這些數(shù)據(jù)解釋了為什么僅僅在弱毒RV感染的細胞或動物才能觀察到細胞凋亡的現(xiàn)象。2.4.2

Rabiesvirus致病機制

137精選課件目前已報道了包括HIV、SARSCoV、EB病毒、柯薩奇病毒(CVB3)、西尼羅河病毒〔WNV〕等10余種病毒誘導宿主細胞蛋白質(zhì)組變化的研究結(jié)果。有必要指出，蛋白質(zhì)功能數(shù)據(jù)庫還很不完善，限制了對差異表達蛋白的功能注釋。因此，僅僅依靠比較蛋白質(zhì)組學方法鑒定的差異表達蛋白完全說明病毒的致病機制是不現(xiàn)實的，在蛋白質(zhì)組研究獲得的大量信息根底上，還需結(jié)合其它技術(shù)方法進一步研究差異表達蛋白在病毒感染和致病機制中的具體作用。138精選課件2.5發(fā)現(xiàn)病毒的作用靶標

通過病毒感染亞細胞蛋白質(zhì)組研究，可以發(fā)現(xiàn)病毒作用于細胞的靶標蛋白。卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒(KSHV)的K5蛋白，是病毒的免疫識別調(diào)節(jié)子，能夠介導多種跨膜蛋白的下調(diào)或降解，并能夠通過下調(diào)MHCⅠ等免