番茄紅素提取工藝的優(yōu)化

番茄紅素提取工藝的優(yōu)化

番茄是一種由多聚烯環(huán)鏈組成的九種胡蘿卜。它具有和平的開環(huán)結(jié)構(gòu)，包括11個普通鍵和2個非公共鍵。這是未通過最后一種無香環(huán)碳?xì)浠衔?。在自然界?番茄紅素主要以全反式結(jié)構(gòu)存在(圖1),從有機(jī)溶劑中析出的番茄紅素純品為針狀深紅色晶體。在成熟的番茄果實中,番茄紅素含量(以100g果實計)可達(dá)1～14mg;在高含量的纖維素番茄果皮中為42.3mg,番茄籽中為4.0mg。在類胡蘿卜素中,番茄紅素的抗氧化性能最強(qiáng),并具有誘導(dǎo)細(xì)胞連接、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、活化免疫等功能。因此番茄紅素逐漸成為功能性食品組成和抗癌(如前列腺癌、消化道癌和膀胱癌等)研究中的熱點。番茄紅素不溶于水,難溶于乙醇和甲醇,可溶于氯仿和苯等有機(jī)溶劑。盡管鹵代烷烴是比較理想的溶劑,但因安全性問題而不適用于食品中番茄紅素的制備。筆者將新鮮番茄去籽,取其果皮,打漿粉碎作為原材料,進(jìn)行番茄紅素的萃取純化。探索在一定預(yù)處理條件下,有機(jī)溶劑及混合溶液、溫度、時間和固液比等對番茄紅素萃取效果的影響,確定以新鮮番茄為原料,提取番茄紅素的最佳萃取工藝條件,為工業(yè)化提取提供實驗依據(jù)。1番茄漿的制備參考文獻(xiàn)和文獻(xiàn)的方法,選用乙醇對番茄漿進(jìn)行洗滌處理。將番茄紅素萃取液在502nm處測定吸光度,比較不同萃取條件下番茄紅素的萃取效果。1.1試劑和機(jī)器1.1.1實驗原材料市售新鮮成熟番茄。1.1.2主要試劑及儀器石油醚、丙酮、乙酸乙酯和乙醇(96%)均為分析純,上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;纖維素酶(比酶活為400U/mg)和果膠酶(比酶活為500U/mg),上?？笊锛夹g(shù)有限公司;番茄紅素純品,上海西寶生物科技有限公司(美國原裝進(jìn)口LKT品牌)。1.1.3儀器、儀器和儀器勻漿機(jī),上海普瑞塞斯儀器有限公司;離心機(jī)、恒溫溫浴鍋,江蘇金壇榮華儀器公司;分光光度計,上海精密科學(xué)儀器有限公司;高效液相色譜儀,中國科學(xué)院上海生化細(xì)胞研究所。1.1.4高效液鉻hplc的實驗條件ODSC18分離柱;流速1.0mL/min;流動相為V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1的混合溶液;柱溫30℃;檢測波長472nm。1.2生長聚合酶ld50-固液萃取-萃取將新鮮番茄去籽打漿粉碎,等分成5份,各試樣編號為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ。Ⅰ號:不調(diào)pH,不加酶;Ⅱ號:將pH調(diào)為8,不加酶;Ⅲ號:不調(diào)pH,加0.07%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)纖維素酶和0.04%果膠酶;Ⅳ號:將pH調(diào)為8,加0.07%纖維素酶和0.04%果膠酶。然后將上述試樣Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ同時置于一個55℃水浴中溫浴2.5h,期間不斷攪拌。將反應(yīng)完的試樣于8000r/min離心10min,棄上層水相。試樣Ⅴ不加酶、不調(diào)pH、未經(jīng)溫浴,直接離心后棄上層水相。各試樣分別用乙醇洗滌沉淀,再離心棄上層乙醇,得較為干燥的番茄渣。按1∶4的固液比(g/mL),在錐形瓶中用V(石油醚)∶V(丙酮)為1∶2的混合溶液于50℃萃取25min。所得的萃取液分別在502nm處測定吸光度?？瞻讓φ沼肰(石油醚):V(丙酮)為1∶2的混合溶液。1.3體積比對測定選用石油醚和丙酮混合溶劑(體積比分別為1∶1、1∶2和1∶4);丙酮和乙酸乙酯混合溶劑(體積比分別為1∶1、1∶2和1∶4);石油醚和乙酸乙酯混合溶劑(體積比分別為1∶1、1∶2和1∶4)為萃取劑。固液比(g/mL)為1∶4,于50℃溫浴萃取25min。所得的萃取液分別于502nm處測定吸光度?？瞻讓φ沼孟鄳?yīng)有機(jī)溶劑的混合溶液。1.4萃取時間的影響以V(石油醚):V(丙酮)為1∶2的混合溶液為萃取劑,固液比(g/mL)為1∶4,分別于25、35、45、50、55℃萃取25min。在502nm處分別測定不同溫度下所得萃取液的吸光度?？瞻讓φ諡閂(石油醚):V(丙酮)為1∶2的混合溶液。1.5萃取劑為固液比的測定以試樣I為萃取原料,選用V(石油醚):V(丙酮)為1∶2的混合溶液為萃取劑,以1∶4的固液比(g/mL)在錐形瓶中50℃萃取,不斷輕微搖晃。在502nm處分別測定5、10、15、25、35、45min的吸光度?？瞻讓φ沼肰(石油醚):V(丙酮)為1∶2的混合溶液。1.6固液萃取條件選用V(石油醚):V(丙酮)為1∶2的混合溶劑,分別以1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶8的固液比(g/mL),在錐形瓶中50℃萃取25min。所得的萃取液分別在502nm處測吸光度?？瞻讓φ沼肰(石油醚):V(丙酮)為1∶2的混合溶液。2結(jié)果與討論2.1番茄紅素的提取不同預(yù)處理方法對番茄紅素的提取影響明顯不同,結(jié)果如圖2和圖3所示。由圖2和圖3可知:試樣Ⅲ的吸光度最高,為1.350,說明酶可以有效地提高番茄紅素的萃取率。試樣I的萃取效果次之,吸光度略低(1.314),但比不做任何處理的試樣Ⅴ的吸光度(1.282)高。在番茄果皮組織細(xì)胞中,番茄紅素以多種形式存在。在果皮細(xì)胞中,番茄紅素存在于質(zhì)體中,并被質(zhì)體膜包圍。除對萃取有利的結(jié)晶態(tài)外,相當(dāng)數(shù)量的番茄紅素與其他組分以復(fù)合體的形式鑲嵌在生物膜上。在工業(yè)化大生產(chǎn)中大量提取番茄紅素,必須打破這些屏障?？赡苁怯捎谠嚇覫在55℃溫浴時,果皮中的酶分解掉了一部分的纖維素和果膠,極大地增加了質(zhì)體與溶劑的接觸面積,打破了提取番茄紅素的屏障,促進(jìn)了溶劑的滲透,使萃取率比不做處理的試樣Ⅴ的萃取率高。當(dāng)有纖維素酶和果膠酶的加入時(試樣III),纖維素和果膠的分解則更為充分,所得的萃取效果更好。在實際生產(chǎn)時,使用纖維素酶和果膠酶會大量增加成本。因此提取番茄紅素的最佳預(yù)處理條件為55℃、溫浴2.5h。試樣II、IV的效果低于I、III的原因可能是pH為8時,部分酶失活導(dǎo)致無法分解番茄中的果膠和纖維素。2.2萃取溶劑為混合溶劑不同萃取溶劑和萃取效果如圖3所示。由圖3可知:單溶劑萃取時,選用乙酸乙酯比石油醚、丙酮的效果好,吸光度達(dá)1.194;石油醚的萃取效果最差,吸光度僅為0.900。選用混合溶劑為萃取劑時,提取率比單溶劑好。其中,石油醚和丙酮為混合溶劑可大大提高番茄紅素的萃取率,兩者體積比為1∶2時,萃取液吸光度達(dá)1.378,明顯高于其他溶劑;且萃取殘渣顏色很淡,萃取液上層的油脂紅色最深,-20℃過夜后,發(fā)現(xiàn)有番茄紅素晶體析出。以石油醚和丙酮為混合溶劑萃取,發(fā)現(xiàn)體積比為1∶1時,油相的量多于體積比為1∶2時的萃取量。為了進(jìn)一步比較哪種比例的萃取液效果好,分別取上層油相,稀釋到相同體積再測定吸光度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)V(石油醚)∶V(丙酮)為1∶1的吸光度為1.270,V(石油醚)∶V(丙酮)為1∶2的吸光度為1.308。故選擇石油醚和丙酮體積比1∶2的混合溶劑為萃取番茄紅素的最佳萃取溶劑。2.3萃取溫度對番茄紅素萃取的影響萃取液在不同溫度下的吸光度見圖4。由圖4可知:隨著溫度的不斷升高,吸光度也隨之增加,即在一定的溫度范圍內(nèi),番茄紅素的萃取率隨溫度的升高而增加。當(dāng)溫度達(dá)55℃時,接近了萃取溶劑的沸點(丙酮沸點為56.48℃),溶劑大量揮發(fā),影響了萃取效果,導(dǎo)致實驗失敗。所以應(yīng)該在溶劑的沸點下,盡量選擇較高的萃取溫度,以提高番茄紅素的提取效果。故確定50℃為最佳萃取溫度。2.4不斷萃取的番茄紅素穩(wěn)定性萃取時間對萃取效果的影響如圖5所示。由圖5可知:在25min之前,吸光度隨時間的延長而增加。說明隨著時間的推移,不斷有番茄紅素從試樣中被萃取出來;而25min后吸光度趨向于平緩,幾乎不再增加,說明此時番茄渣中的番茄紅素基本被萃取完全,達(dá)到穩(wěn)定值,再延長時間對提高萃取效果影響不大。故確定25min為最佳萃取時間。2.5固液比對番茄紅素萃取效果的影響當(dāng)固液比為1∶2、1∶3(g/mL)時,試管內(nèi)有深紅色的番茄紅素晶體析出,說明此時固液比已經(jīng)很高,溶劑量相對偏少,番茄紅素過飽和,導(dǎo)致番茄渣中番茄紅素萃取不充分而浪費原材料。故1∶2、1∶3不是適合的固液比。為了方便分光光度計的測定,進(jìn)行1倍稀釋后測定吸光度,空白對照均為相應(yīng)有機(jī)溶劑的混合溶液。由圖6可知:吸光度隨著固液比的減少而減少,即萃取液中番茄紅素的含量隨固液比的降低而減少。為了減少有機(jī)萃取劑的使用量,提高原料的利用率,用最少的原材料提取更多的番茄紅素,又不使番茄紅素從有機(jī)溶劑里析出,綜合考慮后確定1∶4為最佳固液比。2.6hplc測定按照上文所述的最佳實驗條件,即55℃溫浴2.5h,固液比為1∶4(g/mL)在封口的錐形瓶中,用體積比為1∶2的石油醚與丙酮的混合溶劑為萃取劑,50℃萃取25min后,從新鮮番茄中萃取番茄紅素,用此法所得試樣進(jìn)行HPLC測定。HPLC測定結(jié)果與番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC結(jié)果進(jìn)行比較,結(jié)果如圖7和圖8所示。由番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜(圖7)可知:番茄紅素出峰時間為33min左右。由圖7和圖8可知:最佳萃取條件下所得萃取液在33.248min有明顯出峰,與番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品的相符,說明萃取液內(nèi)含有大量的番茄紅素,而其他時間段雜峰較少。證明所萃取的番茄紅素純度較高。3番茄渣的提取通過對預(yù)處理條件、萃取溶劑、時間、溫度和固液比等影響番茄紅素提取效果的因素進(jìn)行研究和綜合比較。設(shè)計出番茄紅素的最佳提取方法:將新鮮番茄去籽打漿粉碎,55℃溫浴2.5