廣州管圓線蟲感染大小鼠腦組織中水通道蛋白4的表達(dá)

廣州管圓線蟲感染大小鼠腦組織中水通道蛋白4的表達(dá)

廣州管圓蟲病是廣州管圓蟲病引起的重要寄生蟲。廣州管圓線蟲是由我國著名寄生蟲學(xué)家陳心陶教授1935年從褐家鼠肺動(dòng)脈中發(fā)現(xiàn)并命名的。大鼠是其適宜宿主,感染廣州管圓線蟲后癥狀不明顯。小鼠和人是非適宜宿主,感染廣州管圓線蟲后腦部炎癥表現(xiàn)明顯,主要表現(xiàn)為腦脊液中嗜酸性粒細(xì)胞增高性的腦膜炎和腦膜腦炎。有文獻(xiàn)報(bào)道,在感染者中大部分人存在顱內(nèi)壓升高的情況,在治療后仍存在顱內(nèi)高壓,而顱內(nèi)壓升高的原因主要是腦水腫。提示,腦水腫的治療是治愈廣州管圓線蟲病的重要方面,而研究其發(fā)生的機(jī)制是治愈該病的基礎(chǔ)。水通道蛋白(aquaporin,AQP)是一類普遍存在于動(dòng)植物及微生物細(xì)胞膜上,選擇性高效轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的通道蛋白。目前已從哺乳動(dòng)物中鑒定出13種AQP,即AQP0~AQP12。近年來研究發(fā)現(xiàn),AQP-4與腦水腫的形成密切相關(guān),而且在缺血的腦組織中AQP-4的表達(dá)顯著升高。然而,AQP-4在廣州管圓線蟲感染所致的腦水腫中的表達(dá)尚未有研究。因此,本研究擬通過檢測大小鼠感染廣州管圓線蟲后腦組織中AQP-4的表達(dá)水平,及小鼠用小膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑米諾環(huán)素處理后腦內(nèi)AQP-4的水平和腦組織含水量,初步揭示AQP-4在廣州管圓線蟲病中的作用及機(jī)制,為廣州管圓線蟲感染引起的腦水腫的發(fā)病機(jī)制及優(yōu)化現(xiàn)有的治療方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1國外品種見表1清潔級6周齡BALB/c小鼠(24只),雌性,體重18~20g;清潔級6周齡SD大鼠(12只),雌性,體重160~180g,由中山大學(xué)動(dòng)物中心提供,合格證號:0098476。大鼠分為感染0d組(正常組)、感染7d組、14d組、21d組,每組3只。小鼠分為給藥+感染組(M-A組)和單純感染組(AC組),每組又分為感染0d組(即正常組)、感染7d組、14d組、21d組,每組均為3只小鼠。1.1.2感染期的幼蟲本實(shí)驗(yàn)室已建立廣州管圓線蟲生活史循環(huán),感染期蟲體從感染的福壽螺體內(nèi)獲得。1.1.3na反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)劑米諾環(huán)素購自Sigma公司;Trizol購自Invitrogen公司;cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司;SYBR?FastMastermix(2×)RocheLightCycler?480qPCR購自Kapa公司;三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇均購自中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院設(shè)備處供應(yīng)科。1.2方法1.2.1米諾環(huán)素單次感染小鼠給藥方法如下:先將米諾環(huán)素用ddH2O溶解至濃度為200mg/ml,備用。除正常組外,其余小鼠在感染前2h腹腔注射米諾環(huán)素50mg/(kg·d),之后灌胃感染30條幼蟲。每天按此劑量腹腔注射給藥,直到小鼠處死。1.2.2篩網(wǎng)上殘留物將含有感染期幼蟲的福壽螺用刀、鑷子等工具破殼、取肉并充分剁碎、消化(每1L消化液中含胃蛋白酶2g、鹽酸7ml、蒸餾水993ml,37℃消化2h)。消化完畢后,懸液用200~300目篩網(wǎng)過濾,收集濾液。加3~4次ddH2O充分洗滌篩網(wǎng)上殘留物;將篩網(wǎng)上的殘留物棄去,濾液靜置30min以上,待蟲體沉底后,倒去大部分上清;吸取成渣,體視鏡下計(jì)數(shù)蟲體。除正常組外每只小鼠灌胃感染30條幼蟲,每只大鼠灌胃感染100條幼蟲。之后按清潔級標(biāo)準(zhǔn)正常飼養(yǎng),分別在感染后7、14、21d處死大小鼠,取腦組織進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。1.2.3離心條件下合成rna酶將腦組織放入1mlTrizol中,在冰上充分研磨。之后,加入200μl三氯甲烷,在振蕩器上震蕩混勻,4℃13000r/min離心15min。將上清輕輕吸至新的去RNA酶EP管中,加入等體積的異丙醇,輕輕搖勻,4℃13000r/min離心10min。去上清,加入250μl用DEPC水配置的75%乙醇,4℃13000r/min離心1min(此步驟重復(fù)1遍)。風(fēng)干剩余的乙醇,加入40μlDEPC水,吹打混勻,測濃度。1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量pcrgactagct取5μgRNA按Fermentas反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟合成cDNA,并以其為模板用SYBR?GreenⅠ摻入法進(jìn)行RealtimePCR,以β-actin為內(nèi)參,檢測AQP-4的表達(dá)水平。引物如下:大鼠AQP-4:F-TCTTCTGTCCTGACGTGGAG,R-CACCTCCATGTAGCTCCCTT(89bp);小鼠AQP-4:F-TACATGGAGGTGGAGGACAAR-CTCCACGGTCAATGTCAATC(94bp);因?yàn)榇笮∈螃?actin序列相似度非常高,故用同一對引物擴(kuò)增:F-GGCATCCTGACCCTGAAGTA,R-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA(431bp)。RealtimePCR的反應(yīng)體系參考試劑盒說明進(jìn)行設(shè)置,20μl體系中加入0.5μl模板。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2min;95℃15s,60℃15s,72℃15s,40個(gè)循環(huán);95℃30s,60℃30s做溶解曲線,擴(kuò)增結(jié)束。實(shí)驗(yàn)在LightCycler480Real-TimePCRSystem中完成,采用2-△△CT法分析數(shù)據(jù)。1.2.5烘烤時(shí)間的測定小鼠處死后,迅速將腦取出并稱重,此重量為濕重。之后放入烘箱中,110℃烘烤24h,至恒重,取出后再稱重,此重量為干重。然后用以下公式計(jì)算腦組織含水量(%):(濕重-干重)/濕重×100%。1.3方差分析采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,多組間比較采用one-wayanalysisofvariancel(ANOVA)方差分析,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1aqp-4在大鼠體內(nèi)的表達(dá)情況大鼠感染廣州管圓線蟲后腦部雖也有炎癥,但程度較輕。大鼠腦內(nèi)AQP-4的mRNA水平檢測顯示,感染后7d時(shí)AQP-4升高,是感染0d組(正常組)大鼠的2倍多(P<0.05)。但之后呈下降的趨勢,雖稍高于正常,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。2.2小鼠腦內(nèi)和小鼠腦內(nèi)aqp-4水平的變化小鼠感染廣州管圓線蟲后腦內(nèi)炎癥明顯,并且隨著感染時(shí)間的延長而不斷加重。AQP-4mRNA水平檢測顯示,感染后7d,小鼠腦內(nèi)AQP-4的水平升高,為正常組小鼠3倍多(P<0.01);且隨著感染時(shí)間的延長,到感染后14、21d,AQP-4的表達(dá)持續(xù)增加(P<0.01,圖2)。說明AQP-4的水平與炎癥發(fā)展趨勢呈正相關(guān)。2.3m-a的小鼠aqp-4表達(dá)水平的變化米諾環(huán)素是小膠質(zhì)細(xì)胞的抑制劑。給藥后,小鼠AQP-4的mRNA水平被明顯抑制,表達(dá)水平顯著下降。感染后7d時(shí),給藥組(M-A)小鼠的AQP-4表達(dá)水平與單純感染組(AC)小鼠比較明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在感染后14、21d時(shí),AC組小鼠AQP-4水平也是明顯低于M-A組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,圖3)。2.4米諾環(huán)素對小鼠腦水腫的影響腦組織含水量是反應(yīng)腦水腫的有效指標(biāo)。感染廣州管圓線蟲后,小鼠出現(xiàn)腦水腫的癥狀,腦內(nèi)含水量增加。應(yīng)用米諾環(huán)素處理后,小鼠腦組織含水量有不同程度的下降。7d和14d組小鼠下降較明顯,且14d組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖4)。3小膠質(zhì)細(xì)胞感染對腦水腫的影響本研究結(jié)果顯示,非適宜宿主小鼠感染廣州管圓線蟲后腦組織內(nèi)AQP-4的水平明顯上升,在感染過程中均保持高水平。而適宜宿主大鼠卻只是在感染初期有輕度上升,后期則趨于正常。說明AQP-4在感染廣州管圓線蟲的不同宿主中的腦內(nèi)表達(dá)存在差異,與廣州管圓線蟲感染引起的腦炎密切相關(guān)。本課題組前期研究結(jié)果顯示,廣州管圓線蟲四期幼蟲的蟲體抗原對大小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化存在差異,表現(xiàn)為對小鼠能產(chǎn)生更強(qiáng)的活化反應(yīng)。因此,設(shè)想如果抑制小膠質(zhì)細(xì)胞后,是否會(huì)使腦炎和腦水腫也減輕。本研究應(yīng)用小膠質(zhì)細(xì)胞的抑制劑米諾環(huán)素腹腔注射給小鼠,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞后,小鼠腦組織含水量較未給藥的單純感染組明顯下降,且AQP-4的水平也隨之下降。提示,AQP-4升高是廣州管圓線蟲感染后引起腦水腫的重要因素,抑制其增高可有效改善腦水腫,而小膠質(zhì)細(xì)胞可能參與這一過程的調(diào)節(jié)。研究表明,AQP-4在腦內(nèi)主要分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞、腦表面的軟腦膜、腦室系統(tǒng)的室管膜、脈絡(luò)叢、下丘腦的視上核和室旁核。但也有研究顯示,在反應(yīng)性的小膠質(zhì)細(xì)胞中AQP-4的mRNA和蛋白水平都高表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞使AQP-4的水平下降,從反面證明小膠質(zhì)細(xì)胞與AQP-4有關(guān)。但本實(shí)驗(yàn)還未獲得直接證據(jù)證明小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生AQP-4導(dǎo)致腦水腫。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有的重要免疫效應(yīng)細(xì)胞,與中樞炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸關(guān)系密切。已有的研究結(jié)果也顯示,在廣州管圓線蟲感染小鼠腦內(nèi),小膠質(zhì)細(xì)胞隨感染時(shí)間的延長而不斷活化。所以,通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞既可以抑制炎