棉花立枯病盆栽防治木霉菌的篩選

棉花立枯病盆栽防治木霉菌的篩選

傳統(tǒng)的反恐反應(yīng)檢測通常需要分離、盤對比培養(yǎng)和盤對比試驗，最后進(jìn)行現(xiàn)場試驗，這需要時間和工作。此外，在線對抗試驗的結(jié)果往往無法預(yù)測蘑菇的抗菌活性?？焖倏煽康暮罄m(xù)過濾技術(shù)對預(yù)防和控制植物病害非常重要。木霉菌生防菌株的快速篩選,已經(jīng)發(fā)展了凝集素法,但適用范圍有限:ITS-1序列分析方法則更適合于特定菌株的識別,而不能作為快速篩選的一般方法。RAPD(RandomamplifiedpolymorphicDNAs)技術(shù)自1990年首次被Williams和Welsh用于基因組DNA多態(tài)性分析以來,由于具有快速、有效、靈敏度高等特點(diǎn),而且不受環(huán)境條件、發(fā)育狀況的影響,可以客觀地揭示植物、微生物等之間的真實差異。在木霉屬的研究中,利用RAPD技術(shù)對木霉屬菌株進(jìn)行鑒定和分類是可行的。Tyler認(rèn)為,分子標(biāo)記手段特別是其中的RAPD技術(shù),在生防菌的鑒定、差異性分析以及研究生防菌之間的關(guān)系是一個很好的方法。本文將嘗試將RAPD技術(shù)應(yīng)用于生防木霉菌株的篩選。1材料和方法1.1香港自由基可生物酶基因見表1。其中Tg21,TL31為浙江大學(xué)農(nóng)學(xué)院樓兵干老師提供的郁金香致病菌,Tk7a為澳大利亞CSIROLand&WaterM.Ryder博士提供的生物防治菌。其余菌株為本組自不同植物根際分離篩選木霉菌,其中LTR-2是在農(nóng)業(yè)部登記的商品化菌株。1.2棉花消毒和干旱控制參照楊合同方法進(jìn)行。1.3rapp分析1.3.1r/m振蕩培養(yǎng)將各菌株等數(shù)目孢子分別接入PDB培養(yǎng)基,28℃150r/m振蕩培養(yǎng)。第四天時,分別將發(fā)酵液用濾紙過濾,然后放入布氏漏斗用真空泵抽濾,用蒸餾水反復(fù)沖洗,直到濾液無色,菌絲按照參考文獻(xiàn)以SDS抽提法提取基因組DNA。1.3.2pcr檢測taq酶活性290條10bp隨機(jī)引物購自上海生工,PCR儀為Geneamplifier9600。反應(yīng)體系為水640μL,10x緩沖液(不含Mg2+)100μL,10xdNTPs20μL,引物80μL,Taq酶10μL,終體積950μL,模板DNA(10～100ng)每管1μL。PCR循環(huán)過程為:(1)94℃7min變性,35℃1min退火,72℃延伸1min,1個循環(huán);(2)94℃1min變性,35℃1min退火,72℃延伸1min,44個循環(huán);(3)72℃保溫5min。1.3.3遺傳距離矩陣的建立取各管產(chǎn)物各3μL,分別與3μL溴酚蘭混合均勻,用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,EB染色,在暗室紫外燈下觀察,用富士全色膠卷拍照記錄。凝膠圖譜以某條帶在某樣品中出現(xiàn)賦值為“1”和不出現(xiàn)賦值為“0”為依據(jù),計算樣品間的距離系數(shù)D=1-2(nxy)/(nx+ny)。其中,nxy是兩樣品間共有的片段總數(shù);nx,ny分別是樣本x和樣本y的片段總數(shù)。根據(jù)遺傳距離(D),選擇不同的引物擴(kuò)增結(jié)果組合用popGen32軟件包自動生成距離矩陣和UPGMA(UnweightedPairGroupMethodwithArithmeticMean)聚類圖。根據(jù)聚類結(jié)果,找出適合于生防菌篩選的引物組合,繪出高效生防菌株的特征性條帶圖譜。2結(jié)果與分析2.1花立枯病的防治效果38株木霉菌對棉花立枯病的防治效果見表1?？梢娝袦y定的木霉菌對棉花立枯病都有防治效果。顯著性差異測驗表明,菌株對棉花立枯病菌的防治效果有顯著差異。根據(jù)防治效果的高低順序,可將38個菌株劃分為6個組,其中菌株T4,X9,X36,T11和Ag2-1的防治效果為最高。2.2高效木霉菌生防菌株的篩選在所有290條10bp隨機(jī)引物中,有59條產(chǎn)生多態(tài)性擴(kuò)增條帶。每條引物產(chǎn)生的條帶最少2條,引物S71,S171產(chǎn)生的條帶最多,分別達(dá)到14條。條帶最小有500bp,最大有2.3kb。經(jīng)過比較引物產(chǎn)生的多態(tài)性條帶的特征及異同和聚類分析,發(fā)現(xiàn)S1,S42,S60,S122,S146,S147,S171,S180,S181等9條引物產(chǎn)生的共68條多態(tài)性條帶可以用來篩選高效木霉菌生物防治菌株,9條引物的序列見表2。從圖1可以看出,表2中的9條引物能夠區(qū)分開優(yōu)秀生防菌株與其它防效較差的木霉菌株。當(dāng)遺傳距離為21.8時,菌株可分為A,B,C,D,E,F等6個組;其中遺傳距離為11.3時,A組可分為A1,A2兩個亞組,當(dāng)遺傳距離為19.4時,D組可分為D1,D2兩個亞組,A2,D2兩個亞組分別只含防效1級的菌株X9,X36以及T4,T11,Ag2-1。菌株X9,X36聚在Al組,T4,T11,A2-1聚在A3組,顯示了它們有比較近的遺傳距離,與其它生防效果差的菌株有不同的組別。Tk7a是澳大利亞研究很充分的菌株,在小麥病害的防治、蔬菜病害的防治上表現(xiàn)良好,而LTR-2于1997年在我國農(nóng)業(yè)部登記注冊為新農(nóng)藥,雖然這兩個菌株不屬于同一個種,但明顯聚類為一個組。這說明表2中的9條引物在RAPD方法中用于木霉菌生防菌株的初步篩選是可行的。圖2是5條引物對高效菌株T4,T11,Ag2-1和X9,X36的擴(kuò)增模式圖,在利用該組引物進(jìn)行菌株的RAPD篩選時,可作為參考。3木霉菌屬中生防功能的核心基因檢測高效木霉菌類生物防治菌的篩選技術(shù),是限制木霉菌開發(fā)的重要障礙,研究簡單、快捷、準(zhǔn)確的生物防治菌篩選技術(shù)是一個重要而緊迫的課題。RAPD技術(shù)是DNA指紋技術(shù)的一種,可用于把具有同一性狀的個體按遺傳距離的遠(yuǎn)近聚類到一起。本研究把各木霉菌株防治棉花立枯病菌的能力高低作為指示性狀,嘗試發(fā)展木霉菌生防菌株的RAPD篩選技術(shù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)有9條引物對可用于該目的。據(jù)此初步建立了木霉菌高效菌株的RAPD篩選技術(shù)。Zimand用一套引物將優(yōu)秀生防木霉菌株T-39從其它低生防能力的木霉菌株中區(qū)別開來;Ospina-Giraldo等根據(jù)rDNA的ITS序列能夠把對蘑菇致病的和有植病生防功能的木霉菌區(qū)別開;Grondona等結(jié)合生理生化特性研究了木霉菌的ITS序列與生物防治活性的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)菌株的生防活性取決于防治對象和防治活性有關(guān)的功能;Schlick等用微衛(wèi)星和ITS序列測定技術(shù)建立了哈茨木霉菌突變株和專利菌株的識別技術(shù)。本研究表明,RAPD擴(kuò)增結(jié)果在高效菌株間是相似或相同的,高效木霉菌生物防治菌株存在至少部分相似或相同的與生物防治功能有關(guān)的普遍性遺傳基礎(chǔ),在此基礎(chǔ)上能夠發(fā)展具有普遍應(yīng)用價值的以DNA指紋分析為基礎(chǔ)的分子篩選技術(shù),甚至克隆現(xiàn)在還不了解的植病生防功能基因。這說明RAPD技術(shù)不但能夠滿足菌株識別的需要,在合理使用的前提下,也能夠用于高效菌株的篩選。本研究僅利用木霉菌防治棉花立枯病的防治效果作為挑選RAPD隨機(jī)引物的指示形狀,因此所采用的引物是否能夠用來篩選防治其