中藥對(duì)非酒精性脂肪肝的防治作用

中藥對(duì)非酒精性脂肪肝的防治作用

非酒精性肝疾?。╪ad）已成為當(dāng)今社會(huì)最常見(jiàn)的慢性疾病之一。受影響的人正在長(zhǎng)大。nad是肝硬化、肝腫瘤和肝功能衰竭的主要原因。同時(shí)，它與2型糖尿病和硬化性心臟血管的動(dòng)脈病密切相關(guān)。因此,早期治療脂肪肝以控制其病情進(jìn)展,已成為當(dāng)前面臨的重要課題。本研究以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo),以脂肪肝的中醫(yī)病因病機(jī)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)關(guān)于脂肪肝發(fā)病原因?yàn)橐罁?jù),運(yùn)用生物化學(xué)、病理學(xué)的方法和技術(shù),復(fù)制臨床常見(jiàn)的非酒精性脂肪肝大鼠模型,觀察疏肝、健脾、化痰、補(bǔ)腎及多法聯(lián)用的不同治則治法及其代表方藥對(duì)幼年模型大鼠血脂、肝功能、肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響。為中醫(yī)藥防治兒童非酒精性脂肪肝病研究,提供治療思路。1材料和方法1.1動(dòng)物致致動(dòng)物損害四周齡剛斷奶SD大鼠56只,雌雄各半,體重70-85g,平均80g,清潔級(jí),由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物合格證號(hào)為:NO.00005708;高脂飼料由普通飼料加10%豬油、2%膽固醇組成,由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.2化學(xué)試劑及試劑膽固醇購(gòu)于成都科龍化工試劑廠,批號(hào):081203;丙賽優(yōu)購(gòu)于上海朝暉藥業(yè)有有限公司,批號(hào):090404;吐溫80、丙二醇、脫氧膽酸鈉均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)分別為:20090816;T20080629;F20090927。ALT測(cè)定試劑盒,批號(hào):20090235,AST測(cè)定試劑盒,批號(hào):20090225,均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。SOD測(cè)定試劑盒,批號(hào):20091105,美國(guó)RDSYSTEM公司產(chǎn)品,杭州博日科技有限公司進(jìn)口分裝。1.3藥物、文獻(xiàn)組成所有藥品全部由湖北省中醫(yī)院藥事部提供,除綜合方為多法聯(lián)用的經(jīng)驗(yàn)方外,二陳湯,參苓白術(shù)散,柴胡疏肝散的組成劑量參照上?？茖W(xué)技術(shù)出版社出版的第五版方劑學(xué),按中醫(yī)傳統(tǒng)煎藥方法煎煮,濾液濃縮。六味地黃丸為宛西制藥股份有限公司生產(chǎn)的中成藥,批號(hào):081206。人與大鼠劑量的換算參照徐叔云教授編寫(xiě)的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》一書(shū),實(shí)驗(yàn)各治療組均采用中劑量給藥,大鼠用藥量是成人劑量的9倍。疏肝方藥物組成:陳皮、柴胡各6g,川芎、香附、枳殼、芍藥各5g,甘草3g。煎制濃縮后生藥濃度為1.8g/mL,分裝,低溫保存,臨用時(shí)蒸餾水現(xiàn)配至所需濃度。健脾方藥物組成:蓮子、薏仁、甘草各9g,砂仁、桔梗各6g,白扁豆12g,白茯苓、人參、白術(shù)、山藥各15g。煎制濃縮后生藥濃度為1.5g/mL,分裝,低溫保存,臨用時(shí)蒸餾水現(xiàn)配至所需濃度?；捣剿幬锝M成:半夏、陳皮各15g,白茯苓9g,甘草5g。煎制濃縮后生藥濃度為1.2g/mL,分裝,低溫保存,臨用時(shí)蒸餾水現(xiàn)配至所需濃度。補(bǔ)腎方為中成藥六味地黃丸濃縮丸,用時(shí)配置成含生藥濃度為1.0g/mL的溶液。綜合方為多法聯(lián)用,藥物組成:生山楂、澤瀉、白術(shù)、郁金、半夏、陳皮、蒼術(shù)、何首烏各5g,茯苓9g,柴胡6g,赤芍、丹參、枸杞、草決明、炒二芽各10g。煎制濃縮后生藥濃度為1.7g/mL,分裝,低溫保存,臨用時(shí)蒸餾水現(xiàn)配至所需濃度。脂肪乳劑的配制參照文獻(xiàn),加以改進(jìn):取豬油100g加入500mL的燒杯中,放在磁力攪拌器上加熱,待溫度升到100℃時(shí),加入40g膽固醇,溶化;再加入4g丙賽優(yōu),充分?jǐn)噭?然后加入80mL吐溫80,制成油相。同時(shí)在另一燒杯中加入120mL蒸餾水和1,2丙二醇80mL,放在電爐上加熱至60℃,然后加入8g脫氧膽酸鈉,充分?jǐn)嚢柚钡酵耆芙?制成水相。然后將水相加入油相,充分混勻,即制成脂肪乳劑,使用前37℃水浴加熱。1.4儀器和設(shè)備78HG-1型恒溫磁力攪拌器,杭州儀表電機(jī)廠。FA2004型電子天平,上海精天天平廠。HCTP11B10醫(yī)用天平,北京醫(yī)用天平廠。FSH-2型高速電動(dòng)勻漿器,江蘇金壇市恒豐儀器廠。TDL80-2B臺(tái)式離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠。KD-2超薄切片機(jī),浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司。HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋,常州國(guó)華電器有限公司。MODEL-680型酶標(biāo)儀,BIO-RAD公司,Inc。Nikon-YS100型雙目生物顯微鏡,南京光電新興光學(xué)儀器有限公司。1.5實(shí)驗(yàn)方法1.5.1各組綜合組的比較56只SD大鼠正常適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、疏肝組、健脾組、化痰組、補(bǔ)腎組及多法聯(lián)用的綜合組共7組,每組8只。除空白對(duì)照組給普通飼料外,其余6組每天給予脂肪乳1mL/100g體重灌胃,連續(xù)6周,并給予高脂飼料(88%基礎(chǔ)飼料+10%豬油+2%膽固醇)飲食。1.5.2術(shù)后生藥濃度造模第1天開(kāi)始,除空白對(duì)照組、模型組外,其余各組均給予配置好的中藥灌胃。疏肝組給予疏肝液灌胃,按3.6g·kg-1體重,生藥濃度為1.8g/mL,1次/d,連續(xù)6周。健脾組給予健脾液灌胃,按12g·kg-1體重,生藥濃度為1.5g/mL,1次/d,連續(xù)6周?；到M給予化痰液灌胃,按4.6g·kg-1體重,生藥濃度為1.2g/mL,1次/d,連續(xù)6周。補(bǔ)腎組給予補(bǔ)腎液灌胃,按1.8g·kg-1體重,生藥濃度為1.0g/mL,1次/d,連續(xù)6周。綜合組給予綜合液灌胃,按14g·kg-1體重,生藥濃度為1.7g/mL,1次/d,連續(xù)6周。每周稱1次體重,并根據(jù)體重相應(yīng)調(diào)整給藥劑量。實(shí)驗(yàn)第5周模型組死亡兩只。1.6肝組織病理學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)第6周結(jié)束,各組大鼠禁食12h,飲水不限,稱大鼠體重、體長(zhǎng)及肝重,測(cè)體重指數(shù)和肝指數(shù)。體重指數(shù):Lee=體重√3×103/Lee=體重3×103/體長(zhǎng)(為鼻尖到肛門的距離)肝指數(shù):肝重/體重比值大鼠乙醚麻醉,摘眼球取血5mL,分離血清。測(cè)血清中膽固醇(TCH)、甘油三酯(TG),肝功能(ALT,AST)測(cè)定,按相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。切取左前葉肝組織0.5-1.0g,冷生理鹽水沖洗,在冰浴中研磨后稱重加入氯仿:甲醛(2:1),抽取脂質(zhì),4℃下制成10%的肝勻漿,12000轉(zhuǎn)/min,低溫離心15min,取上清液,測(cè)超氧化物歧化物SOD含量。其操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。肝組織病理學(xué)觀察:大鼠處死,分離肝臟,用20%甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,切片,行HE染色,光鏡下觀察。每張切片觀察5個(gè)視野,對(duì)肝脂肪變性程度進(jìn)行分級(jí)、評(píng)分。脂肪變性占30%-50%為輕度(+),50%-75%為中度(++),大于75%為重度(+++)。1.7等級(jí)資料s計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,組間比較采用t檢驗(yàn),等級(jí)資料采用Ridit分析。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。2結(jié)果2.1一般情況下見(jiàn)表1。2.2各組大鼠的血清cth、tg、alt和ast變化見(jiàn)表2。2.3各組肝組織的sod變化見(jiàn)表3。2.4肝組織病理學(xué)檢查2.4.1大鼠肝臟病理模型空白對(duì)照組大鼠肝臟外觀呈暗紅色,未見(jiàn)明顯異常。模型組大鼠腹腔脂肪組織明顯增多,肝臟體積明顯增大,包膜緊張,邊緣圓鈍,呈淡黃色,切面油膩。其他治則的用藥組大鼠肝臟色澤、質(zhì)地、外觀基本介于正常組與模型組之間。其中,補(bǔ)腎及綜合法組大鼠肝臟外觀基本與正常組一致,而疏肝組大鼠肝臟外觀較模型組改變不明顯。2.4.2體制文化對(duì)大鼠肝組織病理學(xué)的影響空白對(duì)照組肝細(xì)胞形態(tài)正常,無(wú)脂肪變性。模型組大鼠肝細(xì)胞增大,胞漿內(nèi)脂滴大小不一,呈中至重度肝細(xì)胞脂肪變性,細(xì)胞水腫嚴(yán)重,匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯,有較多灶性纖維增生。治療組中,補(bǔ)腎組和綜合法組大鼠肝組織無(wú)明顯脂肪性變或可見(jiàn)輕度脂肪變。各用藥組大鼠肝組織均有輕度或中度的細(xì)胞水腫及匯管區(qū)少量的炎細(xì)胞浸潤(rùn)和小灶性纖維增生。各組大鼠肝細(xì)胞脂肪變性程度比較(見(jiàn)表4),經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,正常組與模型組,綜合組、補(bǔ)腎組與模型組均有十分顯著性差異(P<0.01),其他的疏肝組、健脾組、化痰組的各用藥組脂肪變程度較模型組也有不同程度減輕,有顯著性差異(P<0.05)。3成熟以肝為體，藥物治療非酒精性肝損傷據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,在普通飼料中添加膽固醇和豬油喂養(yǎng)大鼠的造模法,12-24周可以形成非酒精性脂肪性肝炎;張志平等研究表明,長(zhǎng)期脂肪乳劑灌胃也可致大鼠非酒精性脂肪性肝病。我們?cè)诒敬螌?shí)驗(yàn)中運(yùn)用脂肪乳劑灌胃的方法上聯(lián)合高膽固醇、高脂肪飼料喂養(yǎng)大鼠,造成非酒精性脂肪肝模型,使造模時(shí)間縮短至6周,測(cè)量鼠重及肝重,檢測(cè)TC、TG、ALT、AST等指標(biāo),顯示空白對(duì)照組和模型組均具有顯著差異性,而肝組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腹腔脂肪組織明顯增多,肝臟體積明顯增大,包膜緊張,邊緣圓鈍,呈淡黃色,切面油膩,胞漿內(nèi)脂滴大小不一,呈中至重度肝細(xì)胞脂肪變性,細(xì)胞水腫嚴(yán)重。表明本次實(shí)驗(yàn)幼年大鼠造成的非酒精性脂肪肝模型是成功的。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)并無(wú)“脂肪肝”這一名稱,根據(jù)臨床改變多將本病歸屬于中醫(yī)學(xué)“脅痛”、“痰濁”、“瘀血”、“積聚”等范疇。大部分學(xué)者認(rèn)為,多為過(guò)食膏梁厚味,酒肉內(nèi)積,七情勞傷等形成的正虛邪實(shí)之證。邪實(shí)則主要表現(xiàn)為濕熱,痰濁與血瘀等;正虛常由于肝腎陰虛,肝失所養(yǎng),導(dǎo)致肝失疏泄,肝血瘀滯;脾失健運(yùn),濕邪不化,痰濁內(nèi)生,氣血不和,瘀阻肝絡(luò)而成。由于脂肪肝的病因病機(jī)復(fù)雜,脂肪肝在臨床上常表現(xiàn)為多種不同的證候或幾種證候夾雜并見(jiàn),所以在臨床上常常采用多種治法方藥聯(lián)合應(yīng)用。但是兒童與成人的生理特點(diǎn)有很大的差別,我國(guó)歷代兒科醫(yī)家通過(guò)長(zhǎng)期的觀察和臨床實(shí)踐,用“稚陰稚陽(yáng)”和“純陽(yáng)之體”概括了小兒生理特點(diǎn)的兩個(gè)方面。提示小兒臟腑嬌嫩,尤以肺、脾、腎三臟表現(xiàn)突出,表現(xiàn)為“腎常虛”,“脾常不足”,“肺常不足”。兒童脂肪肝病主要為嗜食肥甘厚味、飲食失節(jié)和腎先天不足等引發(fā),與情志和飲酒關(guān)系不大。因此,我們針對(duì)兒童脂肪肝病確定中醫(yī)治則主要為“疏肝健脾”、“化痰”、“活血化瘀”、“補(bǔ)腎”等。本實(shí)驗(yàn)選用四周齡剛斷奶SD幼年大鼠,復(fù)制與人類相類似的兒童非酒精性脂肪肝病因、病理特征相似的脂肪肝大鼠模型。并結(jié)合中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論,分別選用“疏肝”、“健脾”、“化痰”、“補(bǔ)腎”為治則的中藥方劑代表方及經(jīng)驗(yàn)綜合方,觀察各中藥方對(duì)