超臨界二氧化碳萃取番茄類胡蘿卜素的研究

超臨界二氧化碳萃取番茄類胡蘿卜素的研究

0超臨界流體萃取法來自美國的番茄已經(jīng)在中國引入了100多年，但現(xiàn)在它在中國各地廣泛種植。番茄已成為我國主要的蔬菜產(chǎn)品之一,我國的番茄育種、栽培和采后加工已初步形成規(guī)?；拖盗谢?據(jù)不完全統(tǒng)計,我國已有不下幾百個栽培品種。它們可分為鮮食型和加工型兩類,鮮食型番茄在我國種植廣泛,其果實可直接食用,鮮食型番茄的產(chǎn)業(yè)鏈因此比較短,易為市場反饋調(diào)節(jié),發(fā)展比較平穩(wěn);加工型番茄在我國的許多地區(qū)也已有大規(guī)模的生產(chǎn),我國西北的新疆地區(qū)擁有龐大的加工型番茄生產(chǎn)能力,年產(chǎn)超過60萬噸,加工型番茄產(chǎn)業(yè)已成為該地區(qū)經(jīng)濟發(fā)展的支柱產(chǎn)業(yè),加工型番茄的果實一般要經(jīng)過加工才為人們食用,因此,加工型番茄的產(chǎn)業(yè)鏈比鮮食番茄的要長,加工環(huán)節(jié)的重要性尤為突出。如果按產(chǎn)量算,我國加工型番茄的單產(chǎn)也可達到4噸/畝的水平,總產(chǎn)堪稱當今加工型番茄生產(chǎn)的大國。根據(jù)我國“十五”發(fā)展規(guī)劃對農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)投資傾斜的政策,考慮到我國迅速發(fā)展的加工型番茄生產(chǎn)基地的產(chǎn)業(yè)發(fā)展情況,尤其我國西北地區(qū)加工型番茄生產(chǎn)基地的產(chǎn)業(yè)發(fā)展情況,發(fā)展加工型番茄的加工與綜合利用技術(shù)是必要的。目前,我國的番茄加工業(yè)每年加工大量的加工型番茄制成多種產(chǎn)品,如番茄罐頭、番茄醬和番茄汁等。同時,這些產(chǎn)業(yè)每年也產(chǎn)生大量的副產(chǎn)品,如:番茄皮渣等。番茄皮渣中富含類胡蘿卜素,特別是番茄紅素和其他無氧胡蘿卜素,因此番茄皮渣被認為是番茄紅素和其他無氧胡蘿卜素的良好的天然資源。從番茄皮渣中制備類胡蘿卜素(主要是番茄紅素)的技術(shù)提供了利用這些皮渣的一種可能性。本項研究著重探討了利用超臨界流體萃取技術(shù)從番茄皮渣中制備番茄紅素的可能性。采用有機試劑從植物組織中提取類胡蘿卜素的方法已經(jīng)建立了很長時間。這種方法的應(yīng)用對象廣泛,而且具有良好的回收率,但應(yīng)用于商業(yè)目的時有一些明顯的缺點,如:成本較高、萃取試劑的毒性所引起的產(chǎn)品安全性問題、時間長等。超臨界流體萃取技術(shù)與傳統(tǒng)的溶劑萃取相比具有一些明顯的優(yōu)點,如:操作成本低、效率高、操作簡單和無毒無污染等。在本項研究中,主要探討用超臨界二氧化碳萃取技術(shù)從番茄皮中制備番茄紅素的可能性。在生物樣本中,類胡蘿卜素可能分布于樣品介質(zhì)的不同部位。類胡蘿卜素從樣品介質(zhì)轉(zhuǎn)移到萃取流體中的過程通常是萃取的限速步驟。在該步驟中兩種過程同時發(fā)生:(1)類胡蘿卜素從樣品介質(zhì)中離開(2)類胡蘿卜素進入萃取流體。第一過程的效率由類胡蘿卜素與樣品介質(zhì)的結(jié)合決定,并受類胡蘿卜素在介質(zhì)中的分布影響。在生物樣本中一些類胡蘿卜素與樣品介質(zhì)的結(jié)合屬物理性質(zhì)的結(jié)合,如:吸附,在大部分情況下,在樣品介質(zhì)中類胡蘿卜素被物理吸附或分配到脂類等其它成分中;類胡蘿卜素也可能與介質(zhì)中其他成分化學(xué)地結(jié)合在一起組成一個復(fù)合體,在生物樣本中已發(fā)現(xiàn)兩種類型的類胡蘿卜素復(fù)合體:類胡蘿卜素-蛋白復(fù)合體和類胡蘿卜素-脂類復(fù)合體,在這些復(fù)合體中,類胡蘿卜素和其它成分的關(guān)系可能是親水的,也可能是疏水的,在這種情況下,萃取液必須能夠減弱類胡蘿卜素與復(fù)合體中其它成分的結(jié)合,否則萃取將是困難的;在樣品介質(zhì)中的類胡卜素也可能以晶體的形式存在,為了提高萃取效率,萃取液必須能破碎并溶解這些晶體,如果類胡蘿卜素的晶體被厚的生物膜或細胞壁包圍,萃取液穿過這些障礙與類胡蘿卜素接觸將是困難的,在這種情況下,樣品的破碎程度對萃取是重要的。在第二過程中,影響萃取效率的關(guān)鍵因素顯然是被萃取的類胡蘿卜素在萃取液中的飽和溶解度。在文獻檢索中發(fā)現(xiàn),許多從生物組織中應(yīng)用超臨界流體萃取類胡蘿卜素的萃取效率很低。即使被萃取的類胡蘿卜素在萃取流體中有很好的溶解度,它們的萃取也需要很長的時間或消耗大量的萃取介質(zhì)。例如:Tonucci和Beecher(1992)采用超臨界CO2流體耗費了5個小時僅從1克番茄醬中萃取了60%的番茄紅素。這個問題嚴重限制了超臨界流體萃取技術(shù)在工業(yè)中的應(yīng)用。在前人的研究中,最有價值的探索是Favati等人于1988年進行的。Favati報道了從植物的葉片材料中萃取胡蘿卜素的經(jīng)驗。Favati等人的研究中最有價值的信息是有關(guān)類胡蘿卜素在超臨界二氧化碳萃取中回收率的數(shù)據(jù)。他發(fā)現(xiàn):在超臨界二氧化碳中含氧的類胡蘿卜素(如:葉黃素,Lutein)的回收率比不含氧的類胡蘿卜素(如:α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素的)低。在40℃下,當壓力從1450升到10150Psi時,β-胡蘿卜素的回收率隨壓力升高而迅速增加,并很快達到90%以上(見圖1[a])。同時,葉黃素的回收率隨壓力升高而增加的速率明顯的緩慢,并最終也達不到90%的回收率(詳見圖1[b])。圖1表明:不含氧的類胡蘿卜素比含氧的類胡蘿卜素在近臨界狀態(tài)下(1450-10150psi,40℃)的二氧化碳中較容易達到更高的回收率。如果應(yīng)用足夠高的壓力,不含氧的類胡蘿卜素完全可被超臨界二氧化碳高效地萃取。MarsiliandCallahan等人也報道了利用超臨界二氧化碳從不同蔬菜中提取α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素的方法(1993)。這就再次證明了利用超臨界二氧化碳有效萃取不含氧的類胡蘿卜素的可能性。顯而易見,類胡蘿卜素在超臨界二氧化碳中的飽和溶解度是影響萃取的一個重要因素,但當前這方面的數(shù)據(jù)很少,Favati等人的結(jié)果實際上用回收率的概念反映了飽和溶解度的變化規(guī)律,因此具有重要意義。在理論上,樣品介質(zhì)中自由存在的類胡蘿卜素的超臨界流體萃取效率主要由它們在萃取液中的溶解性決定。結(jié)合類胡蘿卜素的超臨界流體萃取更加困難,一個成功的萃取過程需要破碎類胡蘿卜素和樣品介質(zhì)間的結(jié)合。Rozzi等人(2002)在這個基礎(chǔ)上又進行了提高萃取效率的探討工作。Rozzi等人應(yīng)用了超過80℃的萃取溫度,并提高了萃取效率,他的工作表明,高溫可能有助于番茄紅素從番茄果皮組織中釋放出來。本試驗工作是基于前人工作的基礎(chǔ),在一定的范圍內(nèi)進行的探索。首先,根據(jù)類胡蘿卜素的物理及化學(xué)性質(zhì),當環(huán)境溫度超過45℃時,類胡蘿卜素的降解就不可避免,所以,番茄紅素的萃取溫度以不超過45℃為宜。其次,番茄紅素在超臨界流體中的飽和溶解度隨壓力的升高而上升,因此,高萃取壓力肯定有助于提高萃取的效率和產(chǎn)率,但考慮到能源成本和設(shè)備的安全性,番茄紅素的萃取壓力一般選定在4000-5000psi范圍內(nèi)。最后需要明確的是:考慮到CO2的消耗,萃取的流速一般限制在2-3毫升/分以內(nèi)。本試驗所作的努力就是在上述范圍內(nèi),力爭提高萃取的效率和產(chǎn)率。1材料和方法1.1氣體產(chǎn)品公司所有用于超臨界流體萃取的溶劑均為HPLC級試劑;二氧化碳(99.9%)來自本地氣體產(chǎn)品公司;番茄紅素(all-E-Ψ,Ψ-carotene)標準樣品由瑞士Hoffmann-laRoche公司提供,并在使用前用HPLC檢驗過純度。1.2外源番茄紅素對皮組織的分離新鮮番茄購自本地超市,手工剝皮,收集的新鮮番茄皮,用研缽研磨至20目后,可立即用于溶劑萃取;或?qū)⑹占男迈r番茄皮在-20℃下冷凍干燥48小時后,可制成干燥的樣品,供超臨界流體萃取之用。用于檢測外源番茄紅素對皮組織吸附的干燥的脫脂番茄皮樣品是通過傳統(tǒng)的溶劑萃取法去掉凍干的番茄皮粉中的全部脂類(包括類胡蘿卜素)制成的。番茄紅素標準品溶液由番茄紅素晶體溶解于二氯甲烷中制成,溶液需通過裝有石油醚(沸程:30-60(C)的氧化鋁柱,除去環(huán)氧化物。1.3超臨界流體萃取基本裝置本實驗中應(yīng)用的超臨界流體萃取基本裝置如圖2(a)所示,包括一個二氧化碳的壓縮泵(Model100D,ISCO,USA)、一個最大容量可達到25毫升的萃取儀(SFXTM2-10,ISCO,USA)和一個控制單元。改造后的系統(tǒng)在壓力調(diào)節(jié)閥前增加了一臺二極管陣列檢測器(ForwardOpticalScanningDetector,Spectral-Physics,USA),用來在線檢測被萃取物在紫外可見光區(qū)的光密度(見圖2(b))。二極管陣列檢測器的流動檢測池可耐壓到7000psi。對超臨界流體萃取基本裝置的改進是本項研究成功的關(guān)鍵,具有一定的創(chuàng)新性。用于測定提取物類胡蘿卜素組成的高壓液相色譜(HPLC)由梯度系統(tǒng)和二極管陣列檢測器組成(Waters600and996,USA)。2實驗計劃2.1豐富的細細資料傳統(tǒng)的用溶劑法從植物組織中萃取番茄紅素的詳細資料已在很多文獻中給出。在本項研究中,丙酮和乙醚被用作萃取試劑,萃取次數(shù)為3-5次,力求達到對類胡蘿卜素的完全萃取。2.2壓力保持正常在本研究中,樣品先經(jīng)過1分鐘靜態(tài)萃取然后進行動態(tài)萃取。在動態(tài)萃取中,通過緩慢放松壓力閥使超臨界流體保持一定的流速,而壓力保持與靜態(tài)萃取時相同。萃取物收集在壓力閥后的收集瓶中。在萃取結(jié)束后,用2.0毫升四氫呋喃清洗包括萃取池、壓力閥和管道在內(nèi)的整個流路,收集四氫呋喃洗滌液,與收集的萃取物合并供分析使用。2.3臨界流量萃取效率的評估超臨界流體萃取效率的評定主要是通過比較超臨界流體萃取物中總的和單獨的類胡蘿卜素的含量與溶劑萃取物的比較來進行的。2.4脫下番茄皮組織對番茄紅素的吸收番茄紅素標準品用四氫呋喃溶解后裝入萃取池中脫脂番茄果皮組織的頂層,萃取前用氮氣吹去四氫呋喃。2.5樣品的預(yù)處理一部分溶劑加入預(yù)先充填在萃取池中的樣品粉末,混勻,使樣品濕潤,但應(yīng)避免過度潤濕,多余的溶劑用氮氣吹去。2.6類胡蘿卜素含量測定萃取物用四氫呋喃定容至3毫升,然后用UV/VIS分光光度計在470nm(番茄紅素的最大吸收峰)處檢測光密度,然后根據(jù)朗伯-比爾定律計算總類胡蘿卜素含量。摩爾吸光系數(shù)為A1%1cm=3450。2.7流動相b乙酸乙酯樣品溶液在注入高效液相色譜前通過吹氮定容在一定適當?shù)捏w積。色譜的固定相為Nova-PakC18色譜柱(4μm,Ф3.9×300mm)。流動相A為乙腈和水(9∶1,v/v),流動相B為乙酸乙酯。洗脫條件為二元線型梯度:流動相B在20分鐘內(nèi)由0%上升到100%,流量為1.0毫升/分,進樣量為20微升,柱溫為25℃,檢測器的波長范圍:250-600nm。根據(jù)各組份的保留時間和吸收光譜與純品的保留時間和吸收光譜的比較,可對各組份定性分析。各類胡蘿卜素組份的定量測定采用內(nèi)標法完成,純品的添加回收率>97%,色譜設(shè)備和方法的重復(fù)性良好(誤差<7%),萃取物的類胡蘿卜素成分由在470nm處的色譜圖積分計算。3結(jié)果與討論3.1樣品中的總類素含量和類素含量通過冷凍干燥測定得知用于本研究的番茄皮含水量為88%。皮中總類胡蘿卜素含量為1.26毫克/克干重,類胡蘿卜素組成見圖3。3.2有長尾巴的峰如上所述,當干燥的番茄皮組織被超臨界二氧化碳動態(tài)萃取時,在萃取液中的類胡蘿卜素470nm處可被在線監(jiān)測。萃取液中的類胡蘿卜素表現(xiàn)為一個有長尾巴的峰(見圖4),這個峰表明二氧化碳萃取皮中的類胡蘿卜(主要為番茄紅素)的效率是不能滿意的,此外,減少樣品數(shù)量并不能改善這個拖尾峰,這個拖尾峰能夠很好地解釋前人所作的類胡蘿卜素超臨界流體萃取工作的低效性,克服這個拖尾峰是獲得滿意的萃取效果的關(guān)鍵。3.3可能的原因是傾斜末端形成顯而易見,發(fā)現(xiàn)拖尾峰形成的原因是改善它的必要條件?？陀^地講,拖尾峰形成的可能原因和分析可概括如下:3.3.1碳氫化合物如上所述,被萃取的類胡蘿卜素大多數(shù)是番茄紅素。從分子結(jié)構(gòu)上來看,番茄紅素是一種碳氫化合物。Favati等人(1988)的工作顯示:只由碳氫組成的胡蘿卜素在超臨界二氧化碳中有很好的溶解性。因此,本試驗中所觀察到的拖尾峰不可能是由于被萃取的胡蘿卜素在超臨界二氧化碳中的溶解性差造成的。3.3.2萃取介質(zhì)的選擇在萃取前,干燥的番茄皮組織被很仔細地破碎。因此,組織中的大多數(shù)類胡蘿卜素分子能有效地暴露于萃取介質(zhì)。因此,拖尾峰不可能是由于萃取介質(zhì)接觸類胡蘿卜素困難所造成的。3.3.3類化合物在萃取過程中的擴散性差被萃取的類胡蘿卜素-主要是番茄紅素-可能在超臨界二氧化碳中擴散很慢。這可能是導(dǎo)致拖尾峰形成的原因之一。這需要下面的實驗來進一步證實。3.3.4萃取過程中類胡蘿卜素的釋放如果皮組織對類胡蘿卜素有很強的吸附,當萃取進行時,類胡蘿卜素是很難從組織中釋放出來的。這也可能是導(dǎo)致拖尾峰形成的原因之一,并需要正面的實驗來進一步證實。3.3.5超臨界二氧化碳萃取如果果皮中的番茄紅素分子與皮組織中的其它分子鍵合在一起,在超臨界二氧化碳萃取時它們也是難以釋放的。超臨界二氧化碳必須首先破碎復(fù)合物才能釋放出番茄紅素分子。這需要下面的實驗來進一步證實和探索。3.3.6從紅素晶體學(xué)中破碎晶番茄紅素是果皮組織的主要類胡蘿卜素。它可能以晶體的狀態(tài)存在。番茄紅素晶體十分穩(wěn)定,甚至在有機溶劑中番茄紅素晶體也難以迅速溶解。超臨界二氧化碳可能不能有效地破碎晶格和溶解它們。如果這是拖尾峰形成的原因,改善拖尾峰的首要任務(wù)就是破碎晶體。這需要進一步的實驗來證實。3.4根據(jù)提交峰形成的可能原因3.4.1靜態(tài)萃取時間如果拖尾峰的出現(xiàn)是由于番茄紅素在超臨界二氧化碳中的擴散系數(shù)低造成的,延長靜態(tài)萃取時間應(yīng)該有助于拖尾峰的改善。因此,在本項實驗中,靜態(tài)萃取時間從1分鐘延長到8分鐘。靜態(tài)萃取時間延長的效果(對峰寬的影響)見圖5。圖5顯示:番茄紅素在超臨界CO2中有良好的擴散系數(shù)。將靜態(tài)萃取時間從1分鐘延長到8分鐘并沒對拖尾峰有明顯的改善。因此,可以做出結(jié)論:拖尾峰的形成不是由于番茄紅素在超臨界CO2中擴散性差造成的。3.4.2脂質(zhì)體柱層析分離和減少番茄紅素分子的吸收峰在萃取之前,純的番茄紅素標樣被吸附在干燥的脫脂組織粉末上,番茄紅素以自由狀態(tài)存在樣品介質(zhì)之中,沒有和組織中其它組分結(jié)合。動態(tài)超臨界流體萃取番茄紅素純品的萃取峰具有一個沒有明顯拖尾的理想峰形(如圖6所示)。圖6是一個明顯的證據(jù)證明處于自由狀態(tài)的番茄紅素分子與番茄果皮組織的吸附是很弱的,超臨界二氧化碳流體很容易使番茄紅素分子離開樣品介質(zhì)。為證實這一結(jié)論,進一步的試驗是增加脫脂組織的量。當脫脂組織的量從100毫克增加到1200毫克時,番茄紅素純品的吸收峰的保留時間僅僅提高了0.8分鐘(見圖7)。這個試驗非常相似一個吸附色譜過程。干燥的脫脂番茄皮粉末被堆積在萃取池中所起到的作用非常相似于柱層析中的固定相。提高組織的數(shù)量相當于延長柱層析的長度。由于脫脂番茄皮組織對純品番茄紅素的吸附相當弱,組織數(shù)量的增加只引起番茄紅素峰保留時間的微小增加。上述試驗證明:番茄果皮組織對番茄紅素的吸附并不是拖尾峰形成的主要原因。3.4.3有機試劑的操作機理類胡蘿卜素的有機試劑萃取效果表明:有機試劑在萃取中可能克服番茄紅素在離開番茄果皮組織時所面臨的困難。在本實驗中,首先選擇四氫呋喃對番茄果皮組織進行預(yù)處理。在進行萃取前,先將少量四氫呋喃加在番茄皮渣上。然后進行超臨界二氧化碳萃取。圖8給出了動態(tài)超臨界二氧化碳萃取經(jīng)過與未經(jīng)過四氫呋喃處理的番茄果皮中類胡蘿卜素的在線監(jiān)測圖。圖8可以清楚地指出:經(jīng)過四氫呋喃處理的番茄果皮中類胡蘿卜素的拖尾萃取峰得到大大的改善。從圖8可以看出:有機試劑的作用是明顯的,其作用機理可以預(yù)測如下:(1)如果番茄紅素分子在番茄果皮組織中與其它成份形成了復(fù)合體,有機試劑可能破壞了這些復(fù)合體,使番茄紅素分子可以較容易地離開番茄果皮組織,進入超臨界二氧化碳流體。(2)如果番茄紅素分子在番茄果皮組織中以難溶解的結(jié)晶形式存在,有機試劑可能有助于破壞這些結(jié)晶,使番茄紅素分子可以較容易地溶解在超臨界二氧化碳流體中。為證實有機試劑的作用機理,6種不同的有機試劑被選擇來進行對樣品的預(yù)處理。其結(jié)果詳見圖9。表1總結(jié)了溶劑及其極性對萃取峰及其改善效果的影響。圖9和表1表明:越是極性弱的有機試劑對組織前處理的效果越明顯。這就證明了這種處理的疏水性本質(zhì)。因此,可以做出結(jié)論:拖尾峰不是由于番茄紅素和組織中其它親水成分形成復(fù)合體造成的,而可能是由于番茄紅素和組織中其它疏水成分形成復(fù)合體或