不同類型土壤脲酶與硝化抑制劑組合對模擬培養(yǎng)的響應

不同類型土壤脲酶與硝化抑制劑組合對模擬培養(yǎng)的響應

1不同培養(yǎng)條件下的土壤酶學變化酶抑制劑和硝化劑用于緩解土壤中每季度酰胺氮和氨氮的脫水，并將氨氮轉(zhuǎn)化為諾3-氮，以減少氮、氨、氮和硫等元素或化合物的損失?？紤]到兩者都對精細氮轉(zhuǎn)化的特定過程起到了作用，因此，僅通過使用某些功能，對精細氮轉(zhuǎn)化的整個過程沒有有效調(diào)整。例如，通過系統(tǒng)研究闡明了精細氮的聯(lián)合使用機制（hq）和硝化劑雙氰胺（cdd）對鈉胺n轉(zhuǎn)化的影響，二氧化鈦轉(zhuǎn)化通過配合使用有效地延遲了硫酸鈉的分解，并在土壤中積累了更長的時間，減少了no3的累積，降低了氮的排放，增加了土壤中氮的肥力，以及對作物氮吸收和籽產(chǎn)量的影響。然而，土壤酶的管理機構尚不清楚。土壤中的硫酸鈉轉(zhuǎn)化受到一些重要的水分和氧化還原酶的影響，如脲酶、硝酸原酶、亞硝酸原酶和丙烯酸原酶的影響。在本工作中，我們使用室內(nèi)模擬測試不同生態(tài)土壤中的四種酶的影響：氧化還原（hq）、氧化還原（hq-d）、雙氰胺（cdd）、hq-cec和hq-d）的反應以及與土壤氮素形態(tài)的相關關系。我們計劃從土壤酶學的角度闡明抑制劑的作用機制，為土壤酶學和生物化學以及硫酸鈉轉(zhuǎn)化的土壤酶學和生物化學方面提供依據(jù)。2材料和方法2.1試驗肥料及抑制劑供試土壤為采自中國科學院沈陽生態(tài)試驗站的草甸棕壤,其基本理化性質(zhì)見文獻.供試肥料為常規(guī)農(nóng)用尿素.脲酶抑制劑選用經(jīng)廣泛研究并證明經(jīng)濟有效的氫醌(HQ).硝化抑制劑為國內(nèi)外普遍使用的雙氰胺(DCD)和包被碳化鈣(ECC).2.2土壤酶活性的測定本試驗包括CK(施用尿素)、HQ(尿素+HQ)、HQ+ECC(尿素+HQ+ECC)和HQ+DCD(尿素+HQ+DCD)4個處理.將草甸棕壤鮮樣500g與0.48%干土重的尿素,0.3%,20%,1%尿素量的氫醌、包被碳化鈣、雙氰胺混勻放入培養(yǎng)瓶,在30°C條件下恒溫培養(yǎng),在一定的培養(yǎng)時間取土樣分別用靛酚藍比色法、酚二磺酸比色法、α-奈胺比色法、醋酸酐-氯化鐵比色法測定土壤脲酶、硝酸還原酶、亞硝酸還原酶和羥胺還原酶活性.數(shù)據(jù)處理和相關性分析采用SPSS10.0統(tǒng)計分析軟件包進行.3結果與討論3.1土壤酶活性變化3.1.1hq、ecc和hq+dcd對蝌蚪酶活性的影響尿素施入土壤后,在土壤脲酶的作用下,經(jīng)由氨基甲酸水解成NH3,再經(jīng)質(zhì)子化轉(zhuǎn)變?yōu)镹H4+.試驗中,各處理在整個培養(yǎng)期間土壤脲酶有兩個活性高峰,分別出現(xiàn)在培養(yǎng)初期(第3天)和后期(第42天)(圖1a).HQ和HQ+ECC與CK相比雖也可使土壤脲酶活性相應降低,但三者之間并沒有顯著差別.HQ+DCD則可使土壤脲酶活性在整個培養(yǎng)期間保持在較低水平.HQ+DCD的脲酶活性降低,不僅可使尿素水解減緩,令其水解產(chǎn)物更多地被土壤吸附而有效減少尿素水解產(chǎn)物NH3的揮發(fā)損失,也可相應減少水解產(chǎn)物NH4+的硝化作用潛勢.HQ作為脲酶抑制劑被證明對脲酶活性有一定的抑制作用,在本研究中,HQ,HQ+ECC和HQ+DCD3處理均含有脲酶抑制劑HQ,但脲酶活性卻有較大差別,說明土壤脲酶活性與尿素水解產(chǎn)物的存在有很大的關系.先前的研究證明HQ+DCD處理可有效調(diào)節(jié)尿素N轉(zhuǎn)化,也是HQ+DCD使脲酶活性在整個培養(yǎng)期間均保持較低水平的原因.3.1.2催化劑的影響Firestone和Tabatabai認為,盡管在土壤中檢測到許多酶,但關于土壤中硝酸還原酶的有價值信息則極少.Knowles認為,在嫌氣條件下硝酸還原酶是反硝化作用過程中的一種重要的酶,催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽.而在好氣條件下,硝酸還原酶則催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,但不一定與反硝化作用有直接或重要的關系.Abdelmagid等通過精密試驗證明土壤中存在硝酸還原酶.此后,硝酸還原酶研究一直與反硝化作用研究伴同出現(xiàn).通常認為,在嫌氣條件下土壤硝酸還原酶活性更強.本工作探討的是催化硝化作用第一階段最后一步即NO2-→NO3-逆反應的硝酸還原酶對抑制劑的響應.在整個培養(yǎng)期間,各處理土壤硝酸還原酶與脲酶相似,也有兩個活性高峰,但出現(xiàn)的時間與脲酶不同,并隨處理的不同發(fā)生相應的變化(圖1b).對森林土壤和草地土壤反硝化作用研究表明,硝酸還原酶初始值較低,其活性也可能相對較低,本試驗結果與其相反,原因可能在于研究對象雖然相同,但催化的反應卻不同.其一為催化硝化作用逆反應的酶,另一為催化反硝化作用的酶.HQ+DCD除第一個活性高峰與其它3個處理同時出現(xiàn)外,第二個活性高峰出現(xiàn)得比其它3個處理更早(圖1b),表明HQ+DCD可比其它處理更快地恢復較強的NO3-還原能力.施抑制劑的處理在整個培養(yǎng)期間硝酸還原酶活性均高于CK,而HQ+DCD的活性則最高,其最可能的原因在于HQ+DCD處理為硝酸還原酶的酶促反應創(chuàng)造了最適的pH條件.有研究表明,硝酸還原酶最適pH為7,本試驗供試土壤pH為6.67,尿素水解后通常會使土壤pH升高,其值可能更接近硝酸還原酶最適pH.而HQ+ECC處理由于CaC2與土壤水反應也可使pH升高,其土壤pH可能遠高于硝酸還原酶最適pH,從而影響該酶活性.抑制劑處理尤其是HQ+DCD使土壤硝酸還原酶活性保持在較高水平,可減少土壤中NO3-的累積,即減少了NO3-淋溶、NO3-作為反硝化作用的底物產(chǎn)生溫室氣體N2O等引起的N損失和環(huán)境污染的可能性.3.1.3土壤還原酶活性由于亞硝態(tài)N(NO2-)和羥胺(NH2OH)通常在土壤中含量極少,只是N轉(zhuǎn)化過程中存在時間極短的兩種中間產(chǎn)物,因此,對好氣條件下兩種酶的研究較少.在好氣條件下,亞硝酸還原酶催化土壤中NO2-轉(zhuǎn)化為NH2OH,但在嫌氣條件下,亞硝酸還原酶為催化反硝化過程的NO2-轉(zhuǎn)化為N2O的酶.土壤亞硝酸還原酶活性的變化趨勢各處理基本相同,即隨培養(yǎng)時間的增加活性逐漸升高,達峰值后逐漸下降(圖1c).這與森林土壤和草地土壤亞硝酸還原酶初始值較低相一致.與土壤硝酸還原酶活性變化相似,施抑制劑處理在整個培養(yǎng)期間亞硝酸還原酶活性均高于CK,HQ+DCD的活性最高.在好氣條件下,亞硝酸還原酶催化土壤中NO2-轉(zhuǎn)化為NH2OH,如果說HQ+DCD處理更高的硝酸還原酶活性加劇了土壤中NO2-的累積,那么HQ+DCD處理同樣高的亞硝酸還原酶活性,則有可能使可能累積的NO2-盡快轉(zhuǎn)化為NH2OH而減少其產(chǎn)生的危害.在好氣條件下,羥胺還原酶催化土壤中NH2OH轉(zhuǎn)化為NH3OH.各處理土壤羥胺還原酶活性的變化趨勢為隨培養(yǎng)時間的增加其活性逐漸升高,并在隨后的培養(yǎng)期間保持較高的酶活性(圖1d).HQ+DCD處理羥胺還原酶活性與其它處理相比最高,其它3處理羥胺還原酶活性差異不顯著.羥胺還原酶催化土壤中NH2OH轉(zhuǎn)化為NH3OH,HQ+DCD處理更高的土壤羥胺還原酶活性可保證土壤中尿素N的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物更多地以NH4+而不是以其它易引起環(huán)境污染和N素損失的氮氧化態(tài)的形式存在.3.2土壤酶活性與各種形態(tài)的關系3.2.1不同處理哌酶活性和nh3間的關系各處理中CK和HQ+ECC脲酶活性與NH4+間不存在顯著的相關關系,而HQ和HQ+DCD脲酶活性與NH4+間均存在顯著的直線相關關系(表1).由于脲酶是水解尿素生成NH4+的酶,因此脲酶活性與NH4+間均存在顯著的直線相關關系是脲酶本身的作用決定的.有關不同處理脲酶活性與NH4+關系的不同的原因值得深入探討.各處理中CK和HQ+ECC脲酶活性與NH3存在顯著和極顯著的冪函數(shù)相關關系,而HQ和HQ+DCD脲酶活性與NH3間不存在顯著的相關關系(表1).由于NH3是尿素在脲酶作用下水解的產(chǎn)物,因此脲酶活性越高,NH3揮發(fā)的可能性越大.相關檢驗驗證了這一點.HQ+DCD和HQ與NH3揮發(fā)間不存在顯著的相關關系的原因可能是二者調(diào)節(jié)了尿素N的轉(zhuǎn)化,而CK和HQ+ECC則可能由于N轉(zhuǎn)化沒得到合理調(diào)節(jié)和存在NH3揮發(fā)的適合條件(高pH,CaC2的作用),使脲酶活性與NH3揮發(fā)間存在顯著正相關關系.各處理脲酶活性與NO3-和N2O含量間沒有顯著的相關關系,證明脲酶活性對硝化作用沒有顯著的影響,驗證了單一抑制脲酶活性并不能減少尿素N的總損失的結論.3.2.2亞硝酸還原酶相關檢驗表明,各處理硝酸還原酶活性與土壤NH4+、NO3-含量,NH3揮發(fā)和N2O排放速率間均無顯著的相關關系.土壤亞硝酸還原酶活性與土壤NH4+含量存在極顯著的線性(CK、HQ和HQ+ECC)或?qū)?shù)正(HQ+DCD)相關關系,即亞硝酸還原酶活性越高,土壤NH4+含量也越高(表2).在好氣條件下,亞硝酸還原酶催化NO2-還原為羥胺,羥胺在土壤羥胺還原酶的作用下還原為NH3,因此土壤亞硝酸還原酶活性與土壤NH4+含量間存在極顯著的正相關關系.有研究認為,反硝化作用酶(包括硝酸還原酶和亞硝酸還原酶)活性與可交換態(tài)銨無顯著相關關系,產(chǎn)生差異的原因是該研究的條件為嫌氣而本研究為好氣,表明不同條件下亞硝酸還原酶的作用機理不同.各處理土壤亞硝酸還原酶活性與土壤NO3-含量均存在極顯著的拋物線相關,即隨著亞硝酸還原酶活性增加,土壤NO3-含量逐漸升高,到一定程度時亞硝酸還原酶活性再增加,土壤NO3-含量逐漸降低(表2).亞硝酸還原酶活性對土壤NO3-含量的影響可能是間接而非直接的,在亞硝酸還原酶活性增加、土壤NO3-含量逐漸升高這一過程中,亞硝酸還原酶活性升高加速了NO2-還原為羥胺的過程,同時也使NO3-還原為NO2-的速度增加,需持續(xù)產(chǎn)生NO3-以保證反應的進行.因此,此階段亞硝酸還原酶活性增加,土壤NO3-含量逐漸升高.但在亞硝酸還原酶活性進一步增加時,對反應起決定作用的是NO2-還原為羥胺的速度而非NO3-還原為NO2-的速度,因此,此階段亞硝酸還原酶活性增加,土壤NO3-含量逐漸降低.各處理土壤亞硝酸還原酶活性與N2O排放速率間同樣存在極顯著的拋物線相關關系,即隨著亞硝酸還原酶活性升高,N2O排放也逐漸升高,到一定程度時亞硝酸還原酶活性再增加,N2O排放則逐漸降低(表2).在好氣條件下,N2O產(chǎn)生于NH3氧化為NO2-及其逆反應過程.亞硝酸還原酶催化NO2-還原為羥胺的硝化作用第一階段的逆反應,因此,亞硝酸還原酶增加,催化該反應越激烈,從中產(chǎn)生的N2O也越多;如果亞硝酸還原酶活性再增加,催化此反應更完全,則產(chǎn)生的最終產(chǎn)物羥胺更多,中間產(chǎn)物N2O減少.已有研究證明,在嫌氣條件下,亞硝酸還原酶變化只對N2O產(chǎn)生極小的影響,本試驗則證明在好氣條件下,亞硝酸還原酶對N2O的影響是顯著和復雜的,高的亞硝酸還原酶可抑制N2O的產(chǎn)生和排放.3.2.3羥胺還原酶活性的影響HQ、HQ+DCD羥胺還原酶活性與土壤NH4+分別呈顯著和極顯著冪函數(shù)和指數(shù)正相關(表3).CK、HQ+ECC處理羥胺還原酶活性與土壤NH4+間無顯著的相關關系.羥胺還原酶催化羥胺還原為氨,因此其活性越高,土壤保持的NH4+越高.同時,可能產(chǎn)生的NH3揮發(fā)也越大.這從羥胺還原酶活性與NH3揮發(fā)顯著和極顯著的冪函數(shù)(CK和HQ+ECC)和線性(HQ和HQ+DCD)正相關可得到驗證(表3).除HQ+DCD外,其余處理羥胺還原酶活性與土壤NO3-含量均呈顯著或極顯著正指數(shù)相關(表3),其原理與亞硝酸還原酶活性與土壤NO3-相關關系相似,可能的機理是間接的.HQ、HQ+ECC羥胺還原酶活性與N2O排放速率間呈顯著正指數(shù)相關(表3),原因可能是羥胺還原酶催化羥胺還原為氨加速了亞硝酸還原酶催化NO2-還原為羥胺的過程,使得該過程的中間產(chǎn)物N2O排放增加.3.3亞硝酸還原酶活性測定由表4可見,不同處理酶活性間相關關系不盡相同.各處理硝酸還原酶活性與脲酶、亞硝酸還原酶、羥胺還原酶活性均沒有顯著的相關關系.CK、HQ+DCD脲酶與亞硝酸還原酶活性呈顯著正線性相關;CK、HQ+ECC脲酶與羥胺還原酶活性呈極顯著冪函數(shù)正相關;HQ+ECC亞硝酸還原酶與羥胺還原酶活性呈顯著冪函數(shù)正相關.土壤與N轉(zhuǎn)化有關酶活性間的相關關系形式所以復雜多變,與不同酶作用底物和催化產(chǎn)物關系密切相關,由于不同處理N形