阿托伐他汀抗動脈粥樣硬化的機(jī)制研究

阿托伐他汀抗動脈粥樣硬化的機(jī)制研究

動脈硬化（as）引起的心腦疾病是人類健康的嚴(yán)重危害之一。隨著研究的不斷深入,炎癥在AS發(fā)病機(jī)制中的作用越來越為人們所重視。一氧化氮(NO)是以L-精氨酸為底物在血管內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶(eNOS)作用下合成的血管舒張因子,具有擴(kuò)張血管、抑制白細(xì)胞黏附、抑制血小板聚集和血管平滑肌增殖等作用,可延緩AS進(jìn)展。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)主要由激活的單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞分泌,是一種多功能的炎性細(xì)胞因子,參與炎癥、免疫反應(yīng),能夠促進(jìn)AS的發(fā)展。故NO、TNF-α可作為衡量AS的相關(guān)指標(biāo),本研究擬通過建立載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠AS模型,檢測阿托伐他汀干預(yù)治療后血清NO、TNF-α的表達(dá),探討阿托伐他汀抗AS機(jī)制。1材料和方法1.1體重2gApoE-/-小鼠,24只,雄性,體重18~22g。由北京維通利華動物中心提供,SPF/UAF級,許可證編號SCXK(京)2006-0008。1.2tnf-elisa試劑盒NO試劑盒購自美國Cayman公司。TNF-αELISA試劑盒購自eBioscience公司。阿托伐他汀鈣片(立普妥),輝瑞制藥有限公司。1.3高脂4周不同給藥劑量對大鼠顆粒養(yǎng)殖的影響ApoE-/-小鼠24只,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為3組:空白對照組、高脂飲食組、高脂他汀組(n=8),分別給予普通小鼠顆粒飲食、高脂飼料、高脂飼料+阿托伐他汀[10mg/(kg·d)],均飼養(yǎng)8周。8周后小鼠摘眼球取血,標(biāo)本離心,分離血清,測血清NO、TNF-α。1.4no產(chǎn)生情況2通過測定血清中穩(wěn)定的氧化代謝產(chǎn)物亞硝酸鹽(NO2)水平表示NO產(chǎn)生情況。采用硝酸鹽還原酶還原硝酸鹽為亞硝酸鹽,然后通過經(jīng)典的Griessreagent檢測亞硝酸鹽,從而測定出NO水平。1.5過氧化物酶標(biāo)記tmb的制備采用ELISA試劑盒測定TNF-α水平,原理:夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗。檢測相抗體經(jīng)生物素標(biāo)記。樣品和生物素標(biāo)記抗體先后加入酶標(biāo)板孔反應(yīng)后,PBS洗滌。隨后加入過氧化物酶標(biāo)記的親和素反應(yīng);經(jīng)PBS的徹底洗滌后,用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化為藍(lán)色,并在酸的作用下最終轉(zhuǎn)化為黃色。顏色的深淺與樣品中的TNF-α呈正相關(guān)。2.2血清no測定的統(tǒng)計結(jié)果2.3tnf-測量的結(jié)果3不同途徑對高脂他汀小鼠血清no、tnf-表達(dá)水平的影響在AS病變發(fā)展過程中,機(jī)體常由于內(nèi)皮功能障礙或受損,導(dǎo)致eNOS表達(dá)或活性下降,內(nèi)源性NO生成減少,由此可導(dǎo)致內(nèi)皮素釋放增加,且斑塊或增厚的管壁內(nèi)滋養(yǎng)動脈對內(nèi)皮素敏感性的異常升高,使血管持久收縮、加劇管腔狹窄,引起心腦血管、高血壓病變。亦有研究顯示冠心病患者血清中NO含量與正常對照組相比明顯下降,故百年來臨床應(yīng)用硝酸酯類藥物提供外源性NO治療、改善缺血性心臟病癥狀就是一個很好的證明。本研究結(jié)果顯示空白對照組及高脂他汀組小鼠血清NO含量比高脂飲食組顯著增高,顯示他汀類藥物能夠調(diào)整NO的表達(dá),可能與其除降脂外的改善血管舒張功能、減少血管炎癥和氧化應(yīng)激損傷、抑制血栓形成和血小板聚集、阻止血小板和白細(xì)胞向血管內(nèi)皮的黏附、穩(wěn)定粥樣硬化易損斑塊、促進(jìn)心血管形成等功能有關(guān)。綜合現(xiàn)有基礎(chǔ)實驗及臨床研究資料,高脂他汀組小鼠血清NO水平較高,分析可能與以下途徑有關(guān):(1)他汀類藥物能顯著降低低密度脂蛋白水平,降低了小窩蛋白-1(Cav-1)的合成,減少eNOS的磷酸化而促進(jìn)NO的產(chǎn)生,從而改善血管功能。(2)可通過降低內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Cav-1的表達(dá)和削弱Cav-1與eNOS的相互作用,導(dǎo)致NO的產(chǎn)生增多。(3)通過降低NADPH氧化酶的表達(dá),抑制內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生超氧陰離子,維持NO與自由基平衡發(fā)揮保護(hù)內(nèi)皮作用。(4)須由eNOS介導(dǎo)發(fā)揮作用。因此,他汀類藥物上調(diào)內(nèi)皮源性NO水平是其抗AS進(jìn)展的多效性之一。研究顯示高脂飲食組小鼠TNF-α水平較高,而許多研究也表明冠心病患者中TNF-α水平也明顯升高;高脂他汀組TNF-α水平較低,揭示可能與阿托伐他汀的抗炎作用有關(guān)。吳旭斌等研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可明顯減少急性冠脈綜合征患者外周血單核細(xì)胞表達(dá)炎癥因子TNF-α,且作用強(qiáng)度呈劑量依賴性,亦支持本研究的結(jié)果。TNF-α可對血管內(nèi)皮細(xì)胞直接產(chǎn)生細(xì)胞毒作用,促進(jìn)中性粒細(xì)胞脫顆粒及氧化代謝,加速脂質(zhì)過氧化,破壞內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性,而損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)一步釋放白細(xì)胞介素1、巨噬細(xì)胞移動抑制因子、血管細(xì)胞黏附分子-1、細(xì)胞間黏附分子-1等的表達(dá),促進(jìn)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等的黏附、聚集及血管內(nèi)皮下遷移作用;還可刺激內(nèi)皮細(xì)胞激活血小板激活因子,使體內(nèi)凝血與抗凝血系統(tǒng)失平衡,導(dǎo)致?lián)p傷部位血栓的形成;間接促進(jìn)MMPs的表達(dá),增加細(xì)胞外基質(zhì)的降解,從而導(dǎo)致斑塊的不穩(wěn)定性。故TNF-α在AS的發(fā)生、發(fā)展、血栓形成及斑塊破裂中起了重要作用,檢測其血清表達(dá)水平可作為預(yù)測心腦血管事件的指標(biāo),降低其活性、表達(dá)水平有利于抑制AS進(jìn)程。另外,本實驗對3組小鼠主動脈弓血管行HE染色,結(jié)果比較可見高脂飲食組及高脂他汀組均可見明顯動脈粥樣硬化斑塊,但后者所示內(nèi)膜增厚、泡沫細(xì)胞含量極少及較厚纖維帽,動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定,故動脈粥樣硬化斑塊形態(tài)結(jié)構(gòu)上亦提示阿托伐他汀具有有效的抗動脈粥樣硬化作用。已知NO及TNF-α與AS相關(guān),本研究通過檢測3組小鼠血清NO水平、TNF-α的水平,顯示高脂他汀組較高脂飲食組小鼠血清NO水平增高,TNF-α含量降低,故提示阿托伐他汀能夠調(diào)整血清NO、TNF-α的表達(dá)而發(fā)揮其抗AS機(jī)制,但其具體信號傳導(dǎo)途徑尚需進(jìn)一步研究。1.6主動脈石蠟色染生理鹽水20mL心臟灌流后取出心臟及主動脈,切取距主動脈根部0.5cm處的主動脈弓,4%多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,行HE染色。1.7統(tǒng)計處理計量資料以表示。組間兩兩比較用t檢驗及卡方檢驗,檢驗水準(zhǔn)α=0.05。所有數(shù)據(jù)用SPSS12.0軟件進(jìn)行處理。2結(jié)果2.1高脂他汀對小鼠血清no、no的影響HE染色結(jié)果顯示AS模型制備成功?？瞻讓φ战M主動脈內(nèi)膜未見明顯增厚,泡沫細(xì)胞含量極少;高脂飲食組小鼠主動脈弓可見明顯動脈粥樣硬化斑塊,內(nèi)膜明顯增厚,其內(nèi)可見大量泡沫細(xì)胞及增生的纖維組織,胞體大,胞漿呈空泡狀,纖維帽薄;高脂他汀組主動脈亦可見明顯動脈粥樣硬化斑塊,內(nèi)膜稍增厚,泡沫細(xì)胞含量極少,可見較厚纖維帽。見圖1。3組結(jié)果相比較,空白對照組小鼠血清NO水平最高,高脂他汀組小鼠血清NO水平居中,高脂飲食組小鼠血清NO水平最低,空白對照組與高脂他汀組結(jié)果比較未見明顯統(tǒng)計學(xué)差