腫瘤標志物在腫瘤病理特征中的表達

腫瘤標志物在腫瘤病理特征中的表達

腫瘤分子特征在腫瘤診斷、入侵和轉移、療效評估和預后預測方面發(fā)揮著重要作用。人類基因組計劃的實施和基因芯片和蛋白質組學技術的應用,發(fā)現(xiàn)了大量腫瘤相關新基因,闡明新基因在腫瘤臨床診斷和預后預測中的作用,篩選新的腫瘤早期診斷和預后預測的分子標志物,迫切需要新技術能大規(guī)模和高通量地研究這些新基因在成百上千例腫瘤的不同發(fā)展階段、不同分化程度和其相應正常組織中的表達。而組織芯片技術為從成千上萬的侯選基因中篩選到與某一疾病類型特異相關的分子標志物提供了新的高通量工具。組織芯片是繼基因芯片和蛋白芯片之后生物芯片家族的又一新成員,能夠有效利用成百上千份正?；蛱幱诩膊顟B(tài)下的組織標本分別在基因、轉錄和翻譯水平上進行研究。本文對組織芯片技術在篩選腫瘤分子標志物中的應用現(xiàn)狀和進展做一簡要綜述。1組織芯片技術的概論1.1組織芯片co-微陣列組織芯片的基本概念來源于1986年Battifora對制作具有多腫瘤組織蠟塊的方法進行了全新改進,通俗稱之為香腸蠟塊(“sausageblock”),該方法是不規(guī)則地放置大量腫瘤組織標本于受體蠟塊中。1998年Kononen等首次對組織芯片技術進行了定義。組織芯片(tissue-chip)又稱組織微陣列(tissuemicroarray,TMA),是從許多供體蠟塊中鑿出的圓形供體組織以微陣列方式重新排列在受體蠟塊上,一個受體蠟塊?？扇菁{400~1000個直徑為0.6~2.0mm的供體組織。組織微陣列可用于各種原位表達研究。1.2本研究標本一般按照樣本數(shù)目的多少,將組織芯片分為低密度組織芯片(200點)、中密度組織芯片(200~600點)和高密度組織芯片(>600點)。組織芯片一般含有50~800例標本。根據(jù)研究目的不同,組織芯片可以分為腫瘤組織芯片、正常組織芯片、單一或復合型組織芯片,以及特定病理類型組織芯片等。腫瘤組織的組織芯片又可分為多腫瘤組織芯片、腫瘤進展和預后組織芯片。多腫瘤組織芯片由不同組織類型的各種腫瘤標本組成,用于檢測在不同腫瘤類型組織中目的基因的表達改變。腫瘤進展組織芯片用于研究在某一特定腫瘤不同病變階段中目的基因的表達改變;預后組織芯片是包括患者臨床隨訪以及臨床終結資料的組織芯片。1.3組織芯片的研究一個普遍關心的問題是在組織芯片中小供體組織用于基因原位表達分析是否能替代常規(guī)的腫瘤組織標本提供有意義的研究結果。已有多個研究中心對常規(guī)的組織切片與組織芯片切片進行對比研究,并對同一組織中鑿取1條供體組織與10條供體組織進行對比研究。研究證實0.6mm大小的供體組織可以代替常規(guī)組織切片,其結果的一致率達95%(2個供體組織)和99.5%(5個供體組織)以上。另有研究表明,常規(guī)福爾馬林固定、石蠟包埋的存檔組織標本用于構建組織芯片、用于基因原位表達的研究是非常有效的。對于高度異質性的腫瘤組織標本,0.6mm大小的組織標本并不能完全獲得所有源于常規(guī)大標本中的信息,組織芯片的研究結果與常規(guī)腫瘤組織切片的結果存在一些差異。盡管如此,有臨床應用價值的一些分子標志物在腫瘤組織中的表達常是相對均一性,因此,組織芯片是適宜于檢測這些重要的已知或具有潛臨床意義的分子靶點。為了增加組織標本的代表性,從同一腫瘤患者的石蠟包埋的不同組織標本或轉移部位的組織標本中鑿取供體組織制作的組織芯片的有效性往往超過常規(guī)腫瘤組織切片。1.4rt-pcr和原位微織構各組的互聯(lián)互通組織芯片不但克服了傳統(tǒng)病理學方法和DNA芯片技術中存在的某些缺陷,而且可與傳統(tǒng)的病理技術、組織化學、免疫組織化學、原位雜交、原位PCR、原位RT-PCR和原位DNA合成等技術相結合,提供大規(guī)模、高通量、快速地在原位組織中對基因的DNA擴增、mRNA的表達豐度和蛋白質的表達水平進行檢測。組織芯片高通量、多樣本、經濟省時、降低誤差、便于設計實驗對照、可與其它生物技術相結合、用途廣泛等優(yōu)點是其日益受寵的原因。盡管組織芯片制作儀價格昂貴,組織芯片技術本身也存在一些缺陷,但一些新型簡潔的組織芯片制作儀器和相關技術的發(fā)明,極大地降低了制作成本并促進了組織技術的推廣應用。2聯(lián)合基因芯片和藥物組織芯片技術已廣泛應用于人類腫瘤的研究中,組織芯片技術在研究腫瘤相關基因的生物學功能及篩選腫瘤相關標志物等方面發(fā)揮了重要作用,與基因芯片聯(lián)合可用于新的腫瘤候選基因的篩選;與FISH和ISH等聯(lián)合可用于基因水平的腫瘤標志物的篩選;與免疫組化聯(lián)合可用于蛋白水平的腫瘤標志物的篩選。目前,組織芯片技術已用于肺癌、鼻咽癌、乳腺癌、肝癌、胃癌和腎癌等多種常見惡性腫瘤的相關分子標志物的研究,并獲得一些具有臨床重要應用價值的分子標志物。2.1her-2/neu與nsclc的臨床信息背景,主要有基因芯片和菌株Tan等利用高密度TMA、免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)和熒光標記的原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)技術在同一實驗條件下檢測了表皮生長因子家族的第2位成員HER-2/neu(也稱C-erbB-2)在140例非小細胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)中的表達,檢測有效率達到了94%,且與傳統(tǒng)的整個病理組織切片方法相比較,實驗結果相差無幾。研究結果顯示HER-2/neu蛋白的過表達與HER-2/neu基因擴增顯著相關,且HER-2/neu基因擴增及其蛋白強陽性表達的患者具有較短的生存期,低分化和高分化腫瘤組織中HER-2/neu表達和基因擴增率的不同,表明HER-2/neu與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展和預后有關。Sugita等結合TMA和基因芯片技術快速篩選和鑒別了與臨床相關的肺癌生物學標記,首先用基因芯片檢測了兩種NSCLC細胞系(A549,H647)和兩種小細胞肺癌(smallcelllungcancer,SCLC)細胞系(SHP-77,UMC-19)的基因表達譜,然后在含187個NSCLC組織標本的芯片上進行免疫組化染色。結果顯示在20種異常高表達的基因中有6種屬于癌/睪丸抗原(cancer/testisantigen,CTAG)基因家族,包括NY-ESO-1和5種MAGE-A亞家族基因,它們在SCLC細胞系中均高表達,而在NSCLC細胞系中NY-ESO-1不表達,MAGE-A低表達;另經免疫組化證實,44%的早期NSCLC細胞胞漿和/或核中表達MAGE-A,認為MAGE-A基因表達與NSCLC(尤其是鱗狀細胞癌)的組織學分型有關,CTAG基因及產物的表達對早期鱗狀癌和小細胞癌的檢測和病情監(jiān)測有重要作用?？梢娀蛐酒cTMA配合使用能夠快速地篩選腫瘤相關基因并評估其生物學意義,有助于建立與診斷、治療和預后有關的指標,構成完整的基因檢測體系。Tan等利用TMA與免疫組化研究了甲狀腺轉錄因子-1(TTF-1)在NSCLCs中的表達及臨床意義,結果顯示TTF-1在肺腺癌中顯著表達,有可能作為NSCLCs的一種預后因素。Deeb等利用Beecher組織微陣列儀從130例肺癌組織(Ι~ША期)石蠟標本中每例鑿取2~3個組織柱制備了組織微陣列,研究發(fā)現(xiàn)E-cad和EGFR的表達情況可作為肺腺癌和肺鱗癌臨床分期的根據(jù),E-cad陰性和E-cad在細胞質中的異位表達與低生存率顯著相關,EGFR的表達與生存率無關。2.2肺癌腫瘤相關基因表達抑癌基因表達下調或缺失與多種惡性腫瘤密切相關。Lo等利用RT-PCR和組織芯片免疫組化染色法研究Ras相關結構域家族基因1A(Rasassociationdomainfamilygene1A,RASSF1A)在鼻咽癌發(fā)病中的作用,發(fā)現(xiàn)鼻咽癌中RASSF1A在基因轉錄和蛋白表達方面均下調,并與WHO腫瘤分期、淋巴結轉移等顯著相關,表明RASSF1A可能作為鼻咽癌的分子標志。87%鼻咽癌臨床標本中存在TSLC1基因表達下調或缺失。Lung等應用組織芯片和免疫組化法檢測肺癌腫瘤抑制物1(tumorsuppressorinlungcancer1,TSLC1)的表達,發(fā)現(xiàn)與原發(fā)鼻咽癌比較,TSLC1在淋巴結轉移的鼻咽癌中表達顯著下調或缺失,提示TSLC1很可能是鼻咽癌淋巴結轉移相關的腫瘤抑制基因。p63是新近被證實的p53家族的成員之一,Guo等構建了包含202例鼻咽癌、29例鼻咽部炎癥病例以及17例正常鼻咽上皮的組織芯片,結合免疫組化法研究p63與鼻咽癌的關系,結果顯示p63在鼻咽癌中高表達(100%,202/202),而在鼻咽部炎癥和正常鼻咽上皮中不表達,p63可作為鼻咽癌診斷的輔助分子標志。Fan等制作了由148例鼻咽癌和164例具有不同病理形態(tài)學特征的非癌性鼻咽上皮組成的含390個組織點陣的鼻咽癌組織芯片,研究EB病毒編碼的小RNA-1(EBER-1)和一些腫瘤相關基因在組織芯片中的表達,結果表明EB病毒感染、p53過表達以及p16和p27蛋白的表達缺失在鼻咽上皮癌變中起重要作用。KIAA1173基因位于染色體3p22.1區(qū),是一個新發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關基因,Zhang等采用組織芯片和原位雜交法證實KIAA1173基因高表達于正常鼻咽黏膜而在鼻咽癌中表達下調,認為KIAA1173很可能是與鼻咽癌癌變相關的新基因。2.3slp-2細胞信號轉導Barlund等將比較基因組雜交(CGH)、cDNA芯片和組織芯片技術相結合研究乳腺癌基因擴增,發(fā)現(xiàn)17q23上至少有2個獨立區(qū)域(S6K和HER-2)呈現(xiàn)高水平擴增;同時用668例原發(fā)性乳腺癌組織芯片進一步證實了在細胞系中的過表達和擴增基因的存在,且其擴增與預后差有關;S6K與HER-2同時擴增與生存期短相關。細胞質膜微囊蛋白-1(caveolin-1)在細胞信號轉導中起重要作用,研究表明細胞質膜微囊蛋白-1與多種癌癥發(fā)生發(fā)展的特定階段密切相關。Liedtke等研究了正常、良性及惡性乳腺組織標本中細胞質膜微囊蛋白-1的表達情況,發(fā)現(xiàn)細胞質膜微囊蛋白-1與乳腺癌的浸潤顯著相關。已經證實SLP-2是一新的腫瘤相關基因,其蛋白在多種癌癥中呈現(xiàn)高水平表達。Cao等應用乳腺癌組織芯片研究發(fā)現(xiàn)SLP-2高表達患者的生存率低,腫瘤體積較大,其淋巴結轉移或遠處轉移的發(fā)生率也較SLP-2低表達者高。2.4波形蛋白的基因組化和病理組織學檢測Richter等用FISH分析cyclinE基因在膀胱癌組織中的擴增情況,發(fā)現(xiàn)其擴增與膀胱癌分級、分期和預后顯著相關。Moch等應用兩種芯片技術研究腎癌細胞系CRL-1933的基因表達狀況。第一步先采用含5148個cDNA克隆的DNA芯片研究腎癌細胞系與正常腎組織之間基因表達的差異,篩選出89個差異表達的基因,發(fā)現(xiàn)其中一個編碼波形蛋白的基因差異最為顯著;第二步用波形蛋白單抗作為探針,免疫組化方法檢測由532個腎癌樣本構成的組織芯片,發(fā)現(xiàn)波形蛋白常見于透明細胞癌和乳頭狀細胞癌,少見于嫌色細胞癌和大嗜酸性細胞癌,同時還發(fā)現(xiàn)波形蛋白與腎癌的預后不良相關,而與疾病分期和病理分化無關。Chen等利用組織芯片檢測頭頸癌中低氧調節(jié)蛋白的表達,發(fā)現(xiàn)細胞核因子κB(NF-κB)抑制物IκB激酶β是一種新型內源性腫瘤低氧性標記物,可能代表一種抗癌治療的新靶標。2.5波形蛋白在肝臟肺癌轉移中的表達Lugli等利用組織芯片分析肝細胞石蠟1(hepatocyteparaffin-1,HepParl)在正常肝臟組織和腫瘤組織中的表達,認為HepParl是鑒別原發(fā)性和繼發(fā)性肝癌的標志。Hu等利用組織芯片技術發(fā)現(xiàn)波形蛋白(vimentin)的過表達與肝細胞肝癌的轉移密切相關,表明波形蛋白過表達在肝細胞肝癌轉移中起著重要的作用。Lee等應用TMA免疫組化方法分析線粒體絲氨酸蛋白激酶Omi/HtrA在60例晚期胃腺癌中的表達,結果發(fā)現(xiàn)陽性表達為43例(72%),而正常胃黏膜的黏液細胞和黏液頸細胞無表達或表達很弱,提示體內胃癌細胞凋亡需要有Omi/HtrA的表達。2.6埃茲蛋白和腦膠質瘤Tynnineu等應用組織芯片技術檢測細胞骨架聯(lián)接蛋白埃茲蛋白(ezrin)在299例原發(fā)性和復發(fā)性星形細胞瘤,以及113例少突膠質細胞瘤、少突星形細胞瘤(均為WHOII~III級)中的表達,發(fā)現(xiàn)細胞埃茲蛋白染色的強度和數(shù)量與星形細胞瘤和少突星形細胞瘤的惡性程度增高有關,在星形細胞瘤中表達最強。同時發(fā)現(xiàn),原發(fā)性膠質瘤中,埃茲蛋白的高表達與復發(fā)、預后差有關,并且在腫瘤進展期間也高表達。研究結果表明,埃茲蛋白表達與膠質瘤進展相關、組織學細胞類型和WHO腫瘤級別有關。此外,Schraml等構建17種惡性腫瘤的組織芯片,含397個腫瘤組織樣本,用原位雜交分析發(fā)現(xiàn),乳腺癌、肺癌、頭頸部及膀胱來源腫瘤和黑色素瘤中有細胞周期素cyclinD1(CCND1)表達;在膀胱、乳腺、結腸、胃、睪丸和肺癌中有ERBB-2表達,ERBB-2是原癌基因ERBB-2編