鼻咽癌p53結(jié)合蛋白的共沉淀組學(xué)分析

鼻咽癌p53結(jié)合蛋白的共沉淀組學(xué)分析

p53基因是一個重要的腫瘤基因，可以阻止細(xì)胞周期，開始細(xì)胞死亡，并維持組織系統(tǒng)的穩(wěn)定。p53基因突變與許多人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。至少50%以上的人類腫瘤存在p53基因的高頻率突變和失敗感。有趣的是，p53基因的突變與其他腫瘤不同。在pc中，p53基因的突變是罕見的，突變頻率低于10%。根據(jù)大量研究，60%以上的敏感性唾液和大多數(shù)潛力性清潔劑含有p53蛋白（過表達(dá)）或聚集（accumia）。此外，p53蛋白的過表達(dá)與鼻子組織的發(fā)育、血管密度、顱底侵蝕、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者預(yù)后與斌氏病毒系統(tǒng)h組有關(guān)。也就是說，對于p53基因聚集的腫瘤患者，細(xì)胞活性物質(zhì)的血管密度增加，腫瘤易遭到破壞和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后低，腫瘤組織經(jīng)常存在未知的病毒。這表明p53蛋白的過表達(dá)是異常的，沒有活動，不能發(fā)揮阻礙細(xì)胞周期和誘導(dǎo)副作用的生物學(xué)作用。此外，p53蛋白的異質(zhì)結(jié)遺傳因子位于鼻細(xì)胞細(xì)胞株的基因治療中。p53蛋白功能失活的主要原因有4個,最常見的原因是p53基因點突變或缺失.其他3個p53蛋白功能失活的原因不涉及p53基因突變,屬于非遺傳原因(extragenic).其一是細(xì)胞蛋白與野生型p53蛋白結(jié)合,如MDM2瘤蛋白與p53結(jié)合后、加速p53蛋白泛素化和降解;其二是野生型p53蛋白核外排(nuclearexclusion),即p53蛋白被分隔(sequestration)于細(xì)胞漿,不能進入細(xì)胞核而發(fā)揮作用,如熱休克蛋白70(HSP-70)和HSP-90家族成員可通過此種方式使p53蛋白功能失活;其三是病毒蛋白與野生型p53蛋白結(jié)合,如SV40大T抗原、HPVE6蛋白、腺病毒E1B和E4/F4蛋白,以及乙肝病毒x抗原(HBx)等與p53蛋白結(jié)合使之失活.由于鼻咽癌中p53突變失活的可能性小,因此極有可能是細(xì)胞蛋白或病毒蛋白與其結(jié)合后使其功能異?；蚴Щ?但至今尚未識別鑒定出鼻咽癌中p53的結(jié)合蛋白.為此,本文以p53蛋白為誘餌,先采用抗p53抗體免疫共沉淀,從鼻咽癌細(xì)胞中的p53結(jié)合蛋白,再采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)技術(shù)對含p53結(jié)合蛋白的復(fù)合物進行分離,然后采用液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(liquidchromatography-tandemelectrospraymassspectrometry,LC-ESI-MS/MS)結(jié)合數(shù)據(jù)庫查詢鑒定p53結(jié)合蛋白,試圖闡明鼻咽癌中p53蛋白聚集及功能異常的分子機制.1材料和方法1.1材料表面1.1.1細(xì)胞鼻咽癌細(xì)胞系HNE1和HNE2由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所建立.用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液進行傳代培養(yǎng).1.1.2抗羊igg的試劑小牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基和蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)為GibicoBRL產(chǎn)品;兔抗人p53多克隆抗體、羊抗人HSP78多克隆抗體、辣根過氧化物酶偶聯(lián)的兔抗羊IgG均為美國SantaCruz公司產(chǎn)品;ECL試劑盒、ProteinGSepharose4Bbeads、TritonX-100、NP-40、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸、Tris、SDS、銀染和考馬斯亮藍(lán)R-250試劑盒均為Pharmacia公司產(chǎn)品;碳酸氫胺(NH4HCO3)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺、TPCK處理的胰蛋白酶(TPCK-trypsin)、三氟乙酸(TFA)均為Sigma公司產(chǎn)品;乙腈(ACN)為國產(chǎn)色譜純.1.1.3設(shè)備SDS電泳儀(Bio-Rad公司),Q-TOFmicroTM(英國Micromass公司).1.2方法1.2.1免疫共沉淀法檢測細(xì)胞總蛋白分別收集對數(shù)生長期的HNE1和HNE2細(xì)胞,加入抽提緩沖液(20mmol/LTris-HCl、pH7.5,150mmol/LNaCl,1mmol/LEDTA,5mmol/LDTT,1%TritonX-100,10%蛋白酶抑制劑混合物,1%磷酸化酶抑制劑Ⅰ,1%磷酸化酶抑制劑Ⅱ),冰上裂解30min,12000r/min、4℃離心15min去除細(xì)胞碎片,吸取上清液,即為細(xì)胞總蛋白,用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度,立即用于免疫共沉淀.1.2.2合成p33s的抗凝劑在含2mg細(xì)胞總蛋白的1ml抽提緩沖液中,加入1μl正常兔血清和30μlproteinG-Sepherose4B珠子,4℃、振蕩2h,9000r/min離心5min去除珠子以消除非特異結(jié)合蛋白,保留上清.在上清液中加入5μl兔抗人p53抗體和30μlproteinG-Sepherose4B珠子,4℃,振蕩過夜,9000r/min離心5min去上清,保留珠子.TBST緩沖液洗滌含免疫復(fù)合物的珠子4次,每次5min,離心收集珠子.以BSA取代p53抗體作為對照.1.2.3proing-東南角的sds-東南角電泳加30μl2×SDS上樣緩沖液(4%SDS,125mmol/LTris-HClpH6.8,4%β-巰基乙醇和10%甘油)于含proteinG-Sepherose4B珠子的試管中,煮沸3min.短暫離心后取上清進行12.5%SDS.電泳結(jié)束后,考馬斯亮藍(lán)R-250和硝酸銀試劑盒進行凝膠染色.實驗重復(fù)5次.1.2.4膜法分離蛋白質(zhì)從膠中切取分辨較好的5條蛋白質(zhì)帶,置于1.5mlEppendorf管中,對經(jīng)兩種染色的蛋白質(zhì)帶分別進行脫色、還原、烷基化、酶解、萃取和脫鹽等處理,將制備好的樣品用于質(zhì)譜分析.1.2.5kv.4細(xì)胞自動進樣的自動分析制備好的樣品在電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(LC-ESI-MS/MS)儀上進行分析.所有測定均在正離子方式下進行.質(zhì)譜儀的校正是用PPG2000串聯(lián)質(zhì)譜碎片校正的,質(zhì)量準(zhǔn)確度小于0.1u.霧化氣體為氮氣,碰撞氣體為氬氣.源溫80℃,錐孔電壓50V左右.TOF加速電壓為0.2kV.MCP檢測器電壓為2.7kV.當(dāng)進行LC-ESI-MS/MS全自動分析時,毛細(xì)管電壓為3000V.自動進樣系統(tǒng)裝備一個C18脫鹽預(yù)柱(長5mm,內(nèi)徑180μm).在進樣后的前3min通過預(yù)柱脫鹽,以后的時間通過梯度洗脫經(jīng)C18毛細(xì)管柱(75μm×15cm)進行肽段分離,分離后直接進入質(zhì)譜儀,儀器一級掃描范圍為400～1600u.一級和二級之間通過母離子強度和母離子電荷自動轉(zhuǎn)換.進行CID的母離子單掃描強度域值設(shè)為5counts,電荷條件設(shè)定為:2、3、4,同時滿足以上兩個條件的一級離子自動進行二級分析.一次分析離子的最大個數(shù)設(shè)定為4,間隔時間0.1s.二級分析7.7s后轉(zhuǎn)換為一級繼續(xù)掃描.碰撞能量根據(jù)肽段電荷和質(zhì)量范圍的不同而異.測定結(jié)果儀器自動以peaklist文件形式給出,通過Mascot查詢SWISSPROT,OWL或NCBI即可對蛋白質(zhì)進行鑒定.也可借助Micromass公司配備的專用軟件MASseq直接推導(dǎo)出肽段序列,再用推斷的序列與肽段質(zhì)量相結(jié)合,查詢數(shù)據(jù)庫對蛋白質(zhì)進行鑒定.1.2.6單次給藥對羊抗人hsp鋼的侵害p53抗體分別與2mgHNE1、HNE2細(xì)胞總蛋白進行免疫共沉淀,收集的蛋白質(zhì)復(fù)合物進行12.5%SDS分離,膠中蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上.印跡膜在5%脫脂牛奶中4℃封閉過夜;在1∶1000稀釋的羊抗人HSP78一抗中室溫溫育2h,PBS洗滌3次,每次10min;在1∶1500稀釋的兔抗羊二抗中室溫溫育2h,PBS洗滌3次,ECL試劑發(fā)光、顯影和定影.未進行免疫共沉淀的100μgHNE1總蛋白凝膠同時電泳、轉(zhuǎn)膜后進行蛋白質(zhì)印跡分析作為對照.2結(jié)果2.1核心蛋白表達(dá)蛋白質(zhì)混合物的分離和鑒定抗p53抗體分別與鼻咽癌細(xì)胞系HNE1和HNE2的總蛋白質(zhì)進行免疫共沉淀,收集的免疫共沉淀蛋白質(zhì)復(fù)合物進行SDS分離,凝膠考馬斯亮藍(lán)染色和銀染后結(jié)果如圖1所示,在HNE1和HNE2細(xì)胞中分別檢測到5條分子質(zhì)量相同的p53結(jié)合蛋白條帶.它們的分子質(zhì)量分別為100ku、75ku、72ku、60ku和25ku左右.實驗共重復(fù)5次,所獲結(jié)果一致.2.2質(zhì)譜、質(zhì)譜條件選擇一個可以移動分子中一個分子分別從電泳凝膠中切取分辨率較好的5條蛋白質(zhì)帶(圖1).經(jīng)過脫色、還原、烷基化、酶解、萃取等處理,樣本凍干后入HPLC的C18毛細(xì)管柱進行梯度洗脫,根據(jù)蛋白質(zhì)疏水強弱對蛋白質(zhì)進行分離,分離后進入質(zhì)譜分析,對同時達(dá)到母離子強度和母離子電荷標(biāo)準(zhǔn)的一級離子進行二級分析(色譜峰見圖2),獲得部分多肽碎片離子的肽序列標(biāo)簽(圖3).2.3grp-97,-actinin4和mcm3蛋白表達(dá)儀器自動以peaklist文件形式給出LC-ESI-MS/MS測定結(jié)果,通過Mascot軟件查詢SWISSPROT,OWL或NCBI數(shù)據(jù)庫成功鑒定了9個蛋白質(zhì)(表1).其中HNE1和HNE2細(xì)胞的蛋白質(zhì)條帶1鑒定了3個蛋白質(zhì),分別是GRP-94,α-actinin4和DNA復(fù)制準(zhǔn)許因子/MCM3蛋白;條帶3鑒定了3個蛋白質(zhì),在HNE1細(xì)胞為GRP-78和LaminA/C,在HNE2細(xì)胞為GRP-75和LaminA/C;HNE1和HNE2細(xì)胞的條帶4鑒定了3個蛋白質(zhì),分別是CD98/4F2heavychain、PKC和Ezrin/Cytovillin.但HNE1和HNE2細(xì)胞蛋白的條帶2和條帶5重復(fù)幾次都未能搜出結(jié)果,可能是蛋白量太小的緣故.2.4hne1和hne2蛋白表達(dá)水平抗人p53抗體分別與HNE1、HNE2細(xì)胞總蛋白免疫共沉淀,免疫復(fù)合物電泳轉(zhuǎn)膜后與抗人HSP78抗體進行蛋白質(zhì)印跡分析.結(jié)果顯示:HNE1蛋白條帶3含p53結(jié)合蛋白質(zhì)HSP78,未進行免疫共沉淀的HNE1總蛋白在相同位置HSP78亦為陽性,而HNE2蛋白條帶3無p53結(jié)合蛋白質(zhì)HSP78(圖4).這與LC-ESI-MS/MS分析鑒定的結(jié)果一致.3細(xì)胞骨架蛋白和p33蛋白相互作用本文應(yīng)用免疫共沉淀與LC-ESI-MS/MS分析相結(jié)合的方法,首次從兩株鼻咽癌細(xì)胞株中鑒定了9個p53結(jié)合蛋白.在鑒定的蛋白質(zhì)中,有的為已知的能與p53蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì).如HSP-70家族成員GRP-78和GRP-75,以及HSP-90家族成員GRP-94.HSP-70和HSP-90家族成員為分子伴侶、具有許多重要的生物學(xué)功能,它們也稱為細(xì)胞死亡和惡性轉(zhuǎn)化的決定因子,通過影響細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)(p53,pRB和p27)的活性而發(fā)揮致瘤作用.HSP-70家族成員GRP-75,GRP-78,HSP-70可與p53穩(wěn)定結(jié)合,導(dǎo)致p53在細(xì)胞漿異常聚集、不能進入細(xì)胞核發(fā)揮作用,并延長p53的半衰期.但至今尚未見鼻咽癌中HSP-70和HSP-90家族成員與p53蛋白結(jié)合的報道.本文在鼻咽癌中識別GRP-78、GRP-75和GRP-94與p53蛋白結(jié)合,這不僅為闡明鼻咽癌中p53聚集及失活的機制提供了實驗依據(jù),而且為進一步通過分子遺傳學(xué)技術(shù)恢復(fù)鼻咽癌中p53的活性、開展鼻咽癌基因治療研究提供了重要線索.本文鑒定的其他p53結(jié)合蛋白是文獻(xiàn)中未見報道的新的p53結(jié)合蛋白,其中有3個細(xì)胞骨架蛋白(LaminA/C、α-actinin4和Ezrin/Cytovillin)和PKC.雖然這些細(xì)胞骨架蛋白與p53蛋白結(jié)合的意義目前尚不清楚,但細(xì)胞骨架蛋白降解是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵事件之一,因此它們是否影響p53蛋白誘導(dǎo)凋亡的功能有待澄清.PKC是細(xì)胞生長和分化信號傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵激酶之一,具有調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞p53活性的作用,但文獻(xiàn)中尚未見在鼻咽癌細(xì)胞中PKC與p53蛋白結(jié)合的報道,其機理和意義有必要進一步研究.另外一個值得關(guān)注的新的p53結(jié)合蛋白是DNA復(fù)制準(zhǔn)許因子(DNAreplicationlicensingfactor),或稱為MCM3蛋白(minichromosomemaintenance3protein,MCM3),MCM3蛋白在進化過程中高度保守,從原核生物到人類均有該因子表達(dá).MCM3蛋白是細(xì)胞周期前復(fù)制物(pre-replicationcomplexes,pre-RC)的關(guān)鍵成分之一,pre-RC在晚M1期和G1期組裝,在S期被活化,然后與DNA復(fù)制啟始位點結(jié)合,啟動DNA的復(fù)制和延伸.文獻(xiàn)報道MCM3蛋白在宮頸癌等腫瘤中高水平表達(dá),并能反映癌組織增殖程度.Schwab等也報道,MCM3蛋白降解與細(xì)胞凋亡有關(guān).因此,MCM3蛋白是否影響鼻咽癌細(xì)胞中p53蛋白功能值得進一步研究.本文識別的另外一個新的p53結(jié)合蛋白是CD98/4F2heavychain,CD98為跨膜糖蛋白,由80～85ku重鏈(4F2heavychain)和40～45ku輕鏈組成,大量的研究顯示,活化的CD98具有促進細(xì)胞增生和轉(zhuǎn)化的作用,但是CD98位于細(xì)胞膜,理論上應(yīng)不能與位于胞漿和胞核中的p53結(jié)合,因此CD98是否為p53的結(jié)合蛋白需進一步實驗驗證.分析鑒定蛋白質(zhì)相互作用的方法有許多,如酵母雙雜交,生物傳感芯片技術(shù),免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析法等.每種方法都有其優(yōu)缺點,如酵母雙雜交是一種高通量的分析相互作用蛋白質(zhì)的方法,適用于大規(guī)模篩選相互作用蛋白.應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)識別相互作用蛋白,靶蛋白本身被作為誘餌(biat)去分離它的結(jié)合蛋白,與酵母雙雜交系統(tǒng)和蛋白質(zhì)芯片技術(shù)比較,該方法主要有如下優(yōu)點:完全加工、修飾和成熟的蛋白質(zhì)被作為誘餌;蛋白質(zhì)的相互作用在接近生理條件下進行;操作簡單,含多個蛋白質(zhì)的復(fù)合物經(jīng)過一步操作就能被鑒定.免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析研究蛋白質(zhì)相互作用的一個重要步驟,是對分離出來的微量蛋白