焦化廠排水底泥上多環(huán)芳烴降解菌的篩選

焦化廠排水底泥上多環(huán)芳烴降解菌的篩選

多環(huán)芳烴（pahs）是環(huán)境中的一般有機(jī)污染物，也是迄今為止發(fā)現(xiàn)和研究的第一個(gè)化學(xué)污染物。多環(huán)芳烴在環(huán)境中污染面廣而分散,不易集中治理,一些環(huán)境微生物經(jīng)過適應(yīng)性馴化和誘導(dǎo),可以對PAHs進(jìn)行代謝分解,甚至礦化。已有研究表明,微生物修復(fù)(降解)是環(huán)境中多環(huán)芳烴去除的最主要途徑。多環(huán)芳烴降解菌的篩選一直是國內(nèi)外生物降解的一個(gè)重要方面。迄今已分離到多種降解菌,但多以降解萘、菲等低分子量PAHs為主。近年來,進(jìn)一步篩選四環(huán)或四環(huán)以上的高分子量PAHs高效降解菌成為多環(huán)芳烴修復(fù)工作的必然趨勢。而芘作為高分子量PAHs的典型代表,常被作為監(jiān)測PAHs污染的指示物和其他PAHs光化學(xué)降解、生物降解的模型分子。因此本實(shí)驗(yàn)以焦化廢水排水溝底泥為優(yōu)良菌源,通過馴化分離篩選出多環(huán)芳烴優(yōu)勢降解菌并對其對芘的降解性能進(jìn)行了初步研究,以期為實(shí)際微生物修復(fù)多環(huán)芳烴污染環(huán)境奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1抗菌、辯證物的制備菌源:焦化廢水毒性大,含多種多環(huán)芳烴及雜環(huán)芳烴,本研究以陜西富平焦化廠焦化廢水排水溝底泥為優(yōu)良菌源,其外觀為半流體,呈黑褐色。馴化實(shí)驗(yàn)用土壤:西安建筑科技大學(xué)小西門內(nèi)東側(cè)花園土。晾干,粗篩(除去樹枝,碎玻璃等雜物),過1mm×1mm篩,備用。1.2培養(yǎng)基的制備5.0g/L芘丙酮標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱量0.2500g芘標(biāo)準(zhǔn)試劑,用丙酮溶解于50mL棕色容量瓶中并定容,搖勻使芘濃度為5.0g/L。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基:牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl5g,蒸餾水1000mL,pH7.2~7.4。121℃高壓蒸汽滅菌30min備用。無機(jī)鹽培養(yǎng)基:磷酸鹽緩沖液:K2HPO4·H2O21.75g,Na2HPO4·12H2O33.4g,KH2PO448.7g,NH4Cl5.0g,蒸餾水1000mL;MgSO4溶液:MgSO422.5g,蒸餾水1000mL;FeCl3溶液:FeCl30.25g,蒸餾水1000mL;微量元素溶液:MnSO439.9mg,ZnSO4·H2O42.8mg,(NH4)MoO24·4H2O34.7mg,蒸餾水1000mL。取上述磷酸鹽緩沖液5.0mL,MgSO4溶液3.0mL,CaCl2溶液1.0mL,FeCl3溶液1.0mL,微量元素溶液1.0mL,定溶至1000mL。經(jīng)高壓蒸汽滅菌,備用。分離純化培養(yǎng)基:在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂,濕熱滅菌后,在無菌操作下加入多環(huán)芳烴碳源混合物,搖勻。然后在滅好菌的培養(yǎng)皿中倒成平板備用或分裝于提前滅菌的帶塞試管中制成斜面?zhèn)溆谩?.3測試方法1.3.1土樣的制備取來含優(yōu)良菌源的污泥后,用均勻處理器處理20min使污泥分散均勻,充分曝氣活化24h。稱取土壤1kg放入自制土壤反應(yīng)器中,加入蒽菲芘各25mg、葡萄糖1g、Mn2+5mg后攪勻,再加入活化后的優(yōu)良菌源,加水?dāng)嚢枋雇寥肋_(dá)一定濕度(目測土壤均勻,松散,潮濕),把反應(yīng)器放入學(xué)校花房溫室(使之通風(fēng)、可接受陽光又免受雨淋),以后每天澆水、攪拌。馴化周期為三個(gè)月。稱取10g馴化后的新鮮土樣于250mL三角瓶中,在無菌操作條件下,加入90mL無菌水,浸泡振搖20min。上清液用無菌水稀釋,分別取107、108、109三個(gè)倍數(shù)的稀釋液各0.2mL于盛有分離培養(yǎng)基的平板中央,用玻璃刮刀均勻涂布,37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d,挑取長勢較好的單一菌落劃線分離,反復(fù)劃線分離,直至獲得純菌株。根據(jù)初步篩選出的優(yōu)良菌對芘的降解情況進(jìn)一步優(yōu)選多環(huán)芳烴降解菌。1.3.2菌懸液的制備無菌條件下,從斜面上挑取一環(huán)菌,接入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,30℃,150r/min恒溫振蕩,好氧培養(yǎng)48h,室溫下6000r/min離心分離30min,用磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗菌體3次,并離心收獲菌體,再用該緩沖液將菌體制備成較濃的菌懸液。1.3.3甲苯用量的測定細(xì)胞表面疏水性采用BATH測定方法,具體為取一定量調(diào)整濃度(OD600=0.530~0.540)的菌懸液4mL于圓底具塞玻璃管中,按梯度加入二甲苯,對照組不加二甲苯。室溫下劇烈振蕩60s,靜置5min分層。用無菌注射針頭快速吸取下相水溶液3.0mL,以磷酸鹽緩沖液為對照,在600nm波長下測定A值,每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。細(xì)菌細(xì)胞表面疏水率(CSH%)按下式計(jì)算:1.3.4酶清效試驗(yàn)優(yōu)良菌對芘的降解過程用MPN法測定菌體的生長情況,具體為將水樣做倍比稀釋,至適宜的稀釋度為止,應(yīng)使低稀釋度的各管都長菌,而以高稀釋度的各管不長菌為宜。每個(gè)稀釋度重復(fù)接種至少3管。37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d,檢查結(jié)果確定數(shù)量指標(biāo),繪制生長曲線。1.3.5初始濃度的確定在150mL錐形瓶中加入適量的無機(jī)鹽培養(yǎng)基,接著準(zhǔn)確加入5.0g/L芘丙酮標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2mL,放入30℃,160r/min的恒溫?fù)u床振搖45min,使丙酮盡快揮發(fā)。隨后取下各瓶,加入一定量的菌懸液使種子濃度為109CFU/mL,使反應(yīng)體系總體積為20m,即芘初始濃度為50mg/L。最后以8層紗布封口,重新放入30℃,160r/min恒溫?fù)u床振搖,分別在反應(yīng)一定時(shí)間后,取下用環(huán)己烷萃取。1.3.6標(biāo)準(zhǔn)曲線法檢測取下反應(yīng)瓶,把水樣用環(huán)己烷在125mL梨形分液漏斗中反復(fù)萃取三次,萃取上清液合并于10mL比色管定容。然后,取0.2mL在另一比色管中稀釋到10mL;在波長為242nm處用紫外分光光度法測其吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成濃度?；貧w直線方程為:y=2.2982x-0.009,R2=0.9996。芘降解率為:芘降解率=(芘初始加入濃度-芘剩余濃度)/芘初始加入濃度×100%(2)2試驗(yàn)結(jié)果與分析2.1優(yōu)良菌株的篩選2.1.1生長時(shí)間及菌落長度的篩選經(jīng)平板劃線分離純化后,共得到30余株多環(huán)芳烴降解菌。在篩選的過程中,根據(jù)各菌種在篩選培養(yǎng)基上生長出來的時(shí)間及菌落的長勢,從30余株中挑選9余株生長時(shí)間快菌落典型的菌種保存。根據(jù)其在馴化篩選培養(yǎng)基上生長快慢,長勢好壞,以及菌落的典型性,綜合考慮選取1#,2#,4#,5#,7#,9#,并保留一組天然混合菌做進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)驗(yàn)。2.1.2菌體表面疏水性對反應(yīng)體系的影響細(xì)菌的細(xì)胞表面疏水性是決定細(xì)菌非特異性黏附到各種生物和非生物表面及界面的最重要的因素之一,也是影響細(xì)菌吸收和降解疏水性有機(jī)物質(zhì)的主要因素之一,因此研究細(xì)菌的細(xì)胞表面疏水性具有一定意義。實(shí)驗(yàn)首先測定了利用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)出的細(xì)菌的菌體表面疏水性,其結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出4#菌的疏水性最大為65.5%,2#菌疏水性次之為50.0%,9#菌的最小為10.2%,1#菌、5#菌、7#菌的疏水性居中,在20%~40%范圍內(nèi)。細(xì)菌表面物質(zhì)成分相當(dāng)復(fù)雜,但只有含有疏水側(cè)鏈或疏水端的成分才決定細(xì)菌的表面疏水性。細(xì)胞壁和膜中的疏水性脂質(zhì)物質(zhì)、親水性低聚糖、不斷重復(fù)的糖蛋白使得脂多糖分子具有兩親性特點(diǎn),菌體表面的憎水性說明細(xì)胞與憎水性的物質(zhì)有較強(qiáng)的相容性。菌體表面性質(zhì)的不同可能影響到細(xì)胞攝取多環(huán)芳烴的方式,進(jìn)而影響到多環(huán)芳烴分子的生物降解過程。按照1.3.5節(jié)中的試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn),試驗(yàn)過程中觀察發(fā)現(xiàn),芘反應(yīng)體系初始有均勻的微小白色片狀物漂浮于水面,溶液呈乳白色。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,體系內(nèi)逐漸出現(xiàn)微小白色泡沫和白色絮體,而空白對照幾乎無變化。萃取過程中發(fā)現(xiàn)降解初期疏水性大的菌株反應(yīng)液乳化嚴(yán)重,隨著降解時(shí)間的延長這種乳化程度變?nèi)?降解初期疏水性小的菌反應(yīng)液在用環(huán)己烷萃取時(shí)乳化不嚴(yán)重,但是隨著降解時(shí)間的延長乳化程度增加。菌體表面疏水性是菌體的非特定性表面性質(zhì),根據(jù)疏水性測定原理可以推測菌體表面疏水性發(fā)生了變化。分別在不同時(shí)刻取下反應(yīng)體系萃取測值,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。從圖2中可以看出隨反應(yīng)時(shí)間的延續(xù),各菌對芘均呈現(xiàn)一定的降解能力(空白對照曲線一直很低),且降解率趨勢總的來說是不斷升高的。在給定反應(yīng)時(shí)間初期2d時(shí),2#菌和4#菌降解率曲線斜率最大,降解最快,此后2#菌降解率稍有回落,之后穩(wěn)固上升,降解速率最快;4#菌降解率回落后降解率曲線保持平緩。9#菌降解曲線波動(dòng)很大,在1~2d穩(wěn)固增加,2~6d曲線稍有回落,接著呈上升趨勢,到第10天大幅度回落,但總的趨勢也是不斷上升的。從第13天的降解率結(jié)果看,2#菌降解最快,其次是5#菌和9#菌。有文獻(xiàn)報(bào)道菌體表面疏水性有可能導(dǎo)致菌體表面對多環(huán)芳烴這類疏水性物質(zhì)的吸附,4#菌疏水性最大,反應(yīng)初期芘的表觀降解率大很可能與菌體表面疏水性大導(dǎo)致芘在菌體表面的吸附結(jié)合有關(guān),而不是真正的降解。從圖2還可以看出天然混合菌的降解并不快,沒有顯示出各菌之間的協(xié)同優(yōu)勢,說明獲得的天然混合菌并一定是降解多環(huán)芳烴的優(yōu)勢組合菌。根據(jù)1.3.4節(jié)的實(shí)驗(yàn)方法,處理數(shù)據(jù)后得到各菌的生長曲線見圖3,由圖3可以看出各優(yōu)良菌種在芘做唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中有不同程度的生長,菌種的生長可以粗略地認(rèn)為都經(jīng)過延滯期、對數(shù)期、平穩(wěn)期、衰減期四個(gè)階段。由圖3中可以看出各菌經(jīng)歷四個(gè)階段所需的時(shí)間不同,穩(wěn)定期均較長。各菌種生長量達(dá)到最大值所需的時(shí)間分別為1#菌需10d,2#菌需5d,4#菌需3d,5#菌需10d,7#菌12d,9#菌需6d。從菌種在以芘為唯一碳源的體系中生長狀況看,菌種能夠以芘為碳源生長,并且生長速度并不慢,生長旺盛。這進(jìn)一步說明它們是好的、能夠代謝分解芘的菌種。各菌種在培養(yǎng)基中的生長周期不同,這是由于各菌種本身的差異,對生長環(huán)境的適應(yīng)能力,以及自身的繁殖能力等。從生長曲線結(jié)果看10d前,4#菌生長最好,其次是2#菌,10d后開始進(jìn)入衰減期,5#菌后期生長較快在第10天達(dá)到其生長量最大值,超過2#菌和4#菌。其他各菌生長曲線變化平緩。從圖2和圖3可以看出在初始芘濃度為50mg/L的體系中,2#菌生長的好也降解的快,5#菌在10d時(shí)生長旺盛,降解率也有增快的趨勢。而4#菌生長良好降解率卻不高,這說明并不是所有生長好的菌,降解率都高。生長能力和降解能力沒有必然聯(lián)系。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取降解效率好,并且具有表面性質(zhì)有代表性的2#、9#菌為對象做本論文下面的實(shí)驗(yàn)。2.2溫度對優(yōu)良菌降解的影響按照1.3.5節(jié)中的方法準(zhǔn)備一批反應(yīng)體系,最后分別放入20℃、25℃、30℃、35℃、40℃,160r/min恒溫?fù)u床振搖。在48h時(shí)取下測定反應(yīng)體系中剩余芘濃度,計(jì)算降解率,以確定溫度對優(yōu)良菌降解芘的影響。試驗(yàn)結(jié)果見圖4,從圖4可以看出,溫度對2#菌和9#菌對芘的降解有一定的影響。對于2#菌在30℃時(shí),對芘降解率最高,48h降解率達(dá)23.57%,小于或大于這個(gè)溫度降解率均變低;對于9#菌情況正好相反,30℃時(shí)降解率最小,溫度增大或變小芘降解率都增加。40℃的降解率相對最高為28.26%。其原因有待進(jìn)一步研究。2.3無機(jī)離子對優(yōu)良菌降解的影響本節(jié)試驗(yàn)研究Mn2+、Zn2+、Co2+、Mo6+、Fe3+、Cu2+各離子對2株優(yōu)良菌對芘降解的影響,并做不加上述離子的對照試驗(yàn)。其中各離子濃度控制在3mg/L,其他操作參見1.3.5節(jié)。在48h時(shí)取下測定反應(yīng)體系中剩余芘濃度,計(jì)算降解率,以確定無機(jī)離子對優(yōu)良菌降解芘的影響。試驗(yàn)結(jié)果見圖5,從圖5中可以看出,對于2#菌Mn2+和Mo6+對降解有促進(jìn)作用,且前者優(yōu)于后者,降解率可以分別提高4%和2%;Co2+、Fe3+、Cu2+均有不同程度的抑制作用,其中Cu2+最為明顯;Zn2+對2#菌的降解沒有影響。對于9#菌各離子對降解沒有明顯的促進(jìn)作用,其中Mn2+、Co2+、Cu2+對降解影響不顯著,而Zn2+和Fe3+均有不同程度的抑制作用,其中Zn2+最為明顯。Mn2+對2#的芘降解有促進(jìn)作用,這可能是由于Mn2+是一些微生物酶的激活劑,可以加快微生物的生化反應(yīng)。2.4葡萄糖對2#、9#菌的降解率以葡萄糖和脲作為外加碳源,外加碳源濃度為100mg/L。其他操作按照1.3.5節(jié)方法進(jìn)行。反應(yīng)48h后測定芘剩余濃度,計(jì)算降解率。結(jié)果如圖6所示。從圖6中可以看出葡萄糖對2#、9#各菌的降解均有促進(jìn)作用,其中對2#菌的促進(jìn)較為明顯,48h可以使降解率提高4%。這可能是由于葡萄糖是微生物生長的良好的營養(yǎng)物質(zhì),它的存在使菌體生命活動(dòng)加強(qiáng),對芘的代謝能力進(jìn)一步加強(qiáng)。脲對2#菌的降解有抑制作用,對9#菌的降解幾乎無影響。其抑制作用很可能是由于脲與芘產(chǎn)生競爭代謝引起的,這一原因有待證實(shí)。3不同菌株對的降解特性(1)以焦化廠廢水溝底泥為菌源馴化分離篩選出6株菌,保存了一組天然混合菌。研究結(jié)果表明,各多環(huán)芳烴優(yōu)勢菌的菌體表面疏水性不同,且這種不同可以影響到反應(yīng)初期菌株對芘的表觀降解率,總的來說菌體的疏水性表面較親水性表面對多環(huán)芳烴有更強(qiáng)的吸附性。菌種的表面疏水性在降解芘的過程中會(huì)發(fā)生變化,總的趨勢是疏水性表面疏水性變小,親水性表面疏水性變大。獲得的一組天然混合菌對芘降解率較低,說明天然混合菌并一定是降解多環(huán)芳烴的優(yōu)勢組合菌。另外,多環(huán)芳烴降解菌在芘培養(yǎng)液中生長能力和降解能力沒有必然聯(lián)系。(2)采用生物搖床進(jìn)行單因素試驗(yàn),對