薏苡仁中氨基酸和蛋白質(zhì)類成分的測定

薏苡仁中氨基酸和蛋白質(zhì)類成分的測定

愛斯隆是水稻科的一種干燥成熟的種子。主要產(chǎn)于中國福建、河北、遼寧等地。這是傳統(tǒng)的中醫(yī)。它具有清熱除濕、健脾、除麻痹、清熱祛膿等功效?？捎糜谒[、排尿不良、氣滯、脾虛腹瀉、寒濕、收縮、肺蠕蟲、腸蠕蟲等的治療?，F(xiàn)代研究表明,薏苡仁含有多種藥理活性的物質(zhì),如酯類、不飽和脂肪酸類、糖類及內(nèi)酰胺類等,具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖的功能,且已有藥物已成功上市。蛋白作為生命結(jié)構(gòu)和功能的重要組成部分,因此具有重要研究價值,近幾十年來禾本科植物種子蛋白也獲得廣泛研究。種子儲藏蛋白根據(jù)其溶解特性可分為四大類:清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。目前有大量關(guān)于小麥、大麥、玉米、高粱、水稻等重要作物種子儲藏蛋白研究,我國尚未有關(guān)于薏苡仁蛋白質(zhì)組成的詳細報道,本實驗對薏苡仁蛋白質(zhì)組成、分子量大小做了較詳細研究,并對氨基酸組成進行了分析。1材料和方法1.1其它試劑分析純薏苡仁購自北京同仁堂藥店(產(chǎn)地福建,批號為20110702),經(jīng)北京中醫(yī)藥大學生藥系劉春生教授鑒定為禾本科植物薏苡的干燥果仁。其它試劑均為分析純。DHG-9053A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司),BP221S型電子分析天平(Sartorius公司),Neofuge23R型臺式高速冷凍離心機(HealForceDevelopmentLtd),SR-JX-4-13型高溫電阻爐(北京市永光明醫(yī)療儀器長),WXG-4型旋光儀(上海申光儀器儀表有限公司)。1.2實驗方法1.2.1b土壤蛋白、氨基酸總成分配比蛋白質(zhì)含量測定:薏苡仁研成粉末,并過40目篩。總蛋白質(zhì)含量、醇溶蛋白和谷蛋白含量測定采用凱式定氮法,精密稱定100mg固體或者5mL蛋白溶液于凱氏燒瓶中,然后依次加入濃硫酸(95%-98%)和催化劑并于熱源上消化,直至消化終點。將定容的消化液蒸餾,并用0.01M的稀鹽酸滴定。樣品中蛋白質(zhì)含量%=(A-B)×0.01×14×6.25×N/(C×1000)×100%A為滴定樣品用去的稀鹽酸平均體積(mL),B為滴定空白用去的稀鹽酸平均體積(mL),0.01為稀鹽酸的當量濃度,14為氮的原子量,6.25為系數(shù),N為樣品的稀釋倍數(shù),C為稱量樣品的重量(g)。清蛋白、球蛋白含量測定采用Brandford方法。旋光法進行淀粉含量測定,烘干法進行水分測定,馬弗爐法進行灰分測定,索氏提取法進行粗脂肪含量測定。1.2.2準準溶液及緩沖液制備蛋白、從蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的活性鈉緩沖液采用順序抽提法進行薏苡仁四大類蛋白的提取。薏苡仁粉末經(jīng)石油醚脫脂,真空干燥,依次用雙蒸水、0.5MNaCl、70%乙醇(5%β-巰基乙醇,0.5%NaAc)、0.0125M硼酸鈉緩沖液(1%SDS,2%β-巰基乙醇)來抽提清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。每組分震蕩抽提1小時,離心9277rcf15min,收集上清液,沉淀用來提取下一組分。1.2.3上樣緩沖液和溴酚藍指示劑復配采用垂直板不連續(xù)體系:分離膠濃度15%,濃縮膠濃度5%。蛋白溶液加入上樣緩沖液后,100℃變性5min,上樣量20μg,恒壓電泳。當溴酚藍指示劑距膠底5mm時,停止電泳?？捡R斯亮藍R-250染色。1.2.4水解真空水精密稱定樣品粉末溶于6MHCl,110℃真空水解24h。水解產(chǎn)物真空干燥后溶于適量0.02MHCl,日立L-8900測定氨基酸含量。2結(jié)果2.1土壤中總蛋白和總灰總蛋白2.薏苡仁主要成分見表1:淀粉為70.84±0.49%,總蛋白含量為14.17±0.27%,而粗脂肪、灰分和水分的含量分別為3.83±0.32%、1.50±0.01%和10.68±0.11%。2.2薏養(yǎng)殖蛋白表達分析采用順序抽提法依次用雙蒸水、0.5MNaCl、70%乙醇(5%β-巰基乙醇,0.5%NaAc)和堿性溶液提取清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白,經(jīng)SDS電泳后,分離結(jié)果如圖1和圖2所示。清蛋白(圖1,3)電泳條帶較多,主要分布在70-10kD之間,且各蛋白間表達量無明顯差異。球蛋白(圖1,2)電泳條帶相對較少,主要分布在50-10kD之間,且蛋白表達量存在著明顯差異,在50、32、14和10kD左右存在著高豐度表達蛋白。醇溶蛋白按照分子量可分為4大類即:α(19和22kD)、β(14kD),γ(16and27kD)和δ(10kD),在薏苡仁中表達量最高的是α-醇溶蛋白,其次是γ;而β和δ-醇溶蛋白表達量較低,條帶不明顯。谷蛋白條帶也較豐富,且存在著表達差異。對四大類蛋白定量分析結(jié)果如表2所示,清蛋白含量為0.20±0.02mg/100mg(鮮重),占薏苡仁總蛋白的1.43%,含量最低;其次是球蛋白,占蛋白質(zhì)含量的6.20%。四類蛋白中,含量最高的醇溶蛋白,其絕對含量和相對含量分別為6.34±0.07mg/100mg和44.74%;谷蛋白含量為37.38mg/100mg。因此,薏苡仁儲藏蛋白中以醇溶蛋白和谷蛋白為主,占總蛋白含量的82.22%。2.3leu和pro的測定采用酸水解法,進行薏苡仁氨基酸含量測定,共檢測到15種氨基酸,其中含量最高的是Glu為3.59mg/100mg,其次是Leu和Pro分別為2.35mg/100mg和1.89mg/100mg。人體必需氨基酸和半必需氨基酸Thr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Lys、His和Arg的含量分別為0.42、1.23、0.17、0.54、2.35、0.46、0.24、0.30和0.44mg/100mg。3不同酸序列比對成品質(zhì)量的影響作為禾本科植物的重要成員之一,薏苡仁的起源、進化、藥物價值的開發(fā)始終是研究熱點之一。隨著蛋白質(zhì)組學的蓬勃發(fā)展,薏苡仁中蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究逐漸引起了人們的興趣。Zhou選取了薏苡仁22-KDα-醇溶蛋白基因家族位點,進行了比較基因組學研究,并提出了高粱、玉米和薏苡該基因家族的進化模型,即三類基因均經(jīng)歷了兩輪的基因擴增:早期的局部基因復制和后期的快速基因擴增。通過氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn),甘蔗、玉米、高粱和薏苡仁醇溶蛋白氨基酸序列同源性在50%以上,有的可高達85%。根據(jù)溶劑不同將儲藏蛋白分為:清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白,其中后兩者所占比例較高。醇溶蛋白作為禾本科植物主要的儲藏成分,約占總蛋白量的50%左右,本實驗中醇溶蛋白占總蛋白的44.74%,與Ottoboni報道的68.3%有一定的差異,其主要原因在于:(1)不同產(chǎn)地、不同品種、不同收獲季節(jié)的材料間蛋白含量存在著明顯的差異;(2)不同的提取方法導致實驗結(jié)果的差異,本實驗所用的提取液為70%乙醇(5%β-巰基乙醇),固液比1:10;而后者使用的抽提液為異丙醇(5%β-巰基乙醇),固液比為1:3;提取液和固液比的不同,導致了提取效率的差異。薏苡作為藥食兩用植物,在民間有著廣泛的應用價值,因此,本研究對其氨基酸含量進行了測定。結(jié)果表明,薏苡仁營養(yǎng)價值較高,共檢測到Thr、Val、Met、Ile、P