薏苡仁多糖對免疫功能低下小鼠的保護作用

薏苡仁多糖對免疫功能低下小鼠的保護作用

自然糖是三種生物活動的秘密之一，在決定生命的秘密方面發(fā)揮著重要作用。許多研究證實,多糖對機體免疫系統(tǒng)具有重要的調節(jié)作用,是其發(fā)揮藥效的主要機制之一,主要表現為免疫增強或刺激作用,是一類頗具應用前景的免疫調節(jié)劑。病理學研究發(fā)現,多糖對機體的免疫調節(jié)作用與它能激活淋巴細胞(lymphocyte)、巨噬細胞,誘生和促進多種細胞因子的分泌有密切關系。天然多糖可起到抗腫瘤,抗病毒,延緩衰老等多種特異生理功能。以薏苡仁多糖(Coixan)純品為研究對象,采用環(huán)磷酰胺建立免疫抑制小鼠模型,檢測受試小鼠的臟器指數,觀察薏苡仁多糖對小鼠細胞免疫器官的保護、修復效果;以腹腔巨噬細胞吞噬指數、淋巴細胞轉化率為衡量指標,觀察薏苡仁多糖對小鼠機體免疫細胞的特異性和非特異性免疫功能的影響。以綿羊紅細胞(SRBC)免疫小鼠,測定致敏小鼠的半數溶血值(HC50)、抗體生成細胞水平,觀察薏苡仁多糖對小鼠體液免疫功能的調節(jié)作用,研究薏苡仁多糖對小鼠免疫功能的影響,探討薏苡仁多糖對機體免疫調節(jié)作用的機制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1薏養(yǎng)殖多糖的制備采集當年產于福建省仙游縣金沙的薏苡仁,以其為原料,粉碎后過200目篩,脫脂,用淀粉酶降解淀粉后采用熱水浸提,乙醇沉淀、冷凍干燥的方法制備薏苡仁多糖粗品。薏苡仁多糖粗品采用酶-Sevag法脫除蛋白質,SephadexG-75凝膠色譜層析;用10ku半透膜流動蒸餾水透析48h,冷凍干燥得薏苡仁多糖純品,樣品純度≥97%。1.1.2養(yǎng)基、新生牛血清、頂空液、頂層環(huán)磷酰胺(Cy)(批號20071017,規(guī)格200mg×5瓶),江蘇恒瑞制藥廠;RPMI1640培養(yǎng)基、新生牛血清、Hanks液體、都氏液、綿羊紅細胞(SRBC),美國Hyclone公司;四氮唑鹽(MTT)、刀豆蛋白(ConAⅣ)四型,Sigma公司。ThermoMK3型酶標儀,上海熱點儀器有限公司;微量血凝試驗板、96孔板、Co-150CO2培養(yǎng)箱,美國;752分光光度計,上海市第三分析儀器廠。1.2動物飼養(yǎng)及給藥方式清潔級ICR小鼠60只,體重(20±2)g,由福建省疾病預防控制中心提供。試驗動物生產許可證號SCXK(閩)2005-0001,試驗動物使用許可證號SYXK(閩)2005-0001。將小鼠隨機分為5組,每組12只,雌雄各半,飼以高壓滅菌的嚙齒類動物飼料,自由攝水,室溫保持(25±1)℃。分別設正常組(生理鹽水)、模型組(生理鹽水)、薏苡仁多糖純品高劑量組[1000mg/(kgbwd)]、中劑量組[500mg/(kgbwd)]和低劑量組[250mg/(kgbwd)]。除正常組(生理鹽水)外,其余4組第1周連續(xù)7d腹腔注射0.2mL環(huán)磷酰胺[50mg/(kgbwd)]造模,形成免疫機能低下。飼養(yǎng)與給藥方式:正常組、模型組每日灌胃0.5mL生理鹽水,其它3組每日分別灌胃高、中、低劑量的薏苡仁多糖溶液各0.5mL,給藥周期28d。小鼠規(guī)格、造模、分組、飼養(yǎng)與給藥方式同本文1.2.1節(jié)。連續(xù)灌胃21d后,D22每鼠腹腔注射0.2mL2%綿羊紅細胞(SRBC)進行免疫,1周后(周內繼續(xù)灌胃給藥)測定血清溶血素、抗體生成細胞。1.3指標和方法的測量1.3.1免疫器官指數的測定連續(xù)灌胃28d后,禁食12h,稱重;頸椎脫臼法處死,無菌剝取脾臟和胸腺,去除周圍脂肪和結締組織,稱其濕重,計算臟器指數。1.3.2刀豆蛋白刺激劑對小鼠的影響1)小鼠脾細胞懸液的制備無菌取脾臟,置盛有Hank’s液的平皿中,于綱網上剪碎,用針芯輕輕研磨,即單細胞懸液;1000r/min離心10min,棄上清液,洗滌2次,進行細胞記數。細胞沉淀用C-RPMI1640培養(yǎng)液調至含量為1×106/mL。2)取100mL新鮮分離的1×107/mL小鼠脾細胞懸液于96孔細胞培養(yǎng)板中,加入100mL刀豆蛋白刺激劑(ConA),每個樣品設3個平行孔,并設對照孔(僅加C-RPMI1640)。每孔總體積200mL,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h,取出平板,棄上清液100mL,分別加入10mL5mg/mLMTT,繼續(xù)培養(yǎng)4h,取出培養(yǎng)板,各加入10%HCL-SDS裂解液(溶于雙蒸水)100mL/孔,繼續(xù)培養(yǎng)8h,取出,用酶標儀于570nm處比色測定OD值。1.3.3細胞培養(yǎng)及測定1)小鼠巨噬細胞懸液的制備無菌操作。將取血后的小鼠固定于解剖盤,腹腔注無血清的RPMI-1640營養(yǎng)液5mL,撫摸數分鐘后,剪開腹腔,用巴氏管將營養(yǎng)液吸出至滅菌試管中,2000r/min離心15min。細胞沉淀用含10%新生牛血清的RPMI-1640營養(yǎng)液洗滌3次,細胞計數,配成1×105/mL的溶液。2)將1×105/mL細胞液以每孔100μL加入96孔板中,每鼠3孔,正常組2孔(同一板共用),于37℃,5%CO2培養(yǎng)4h使巨噬細胞貼壁;加MTT20μL(5mg/mL孔),同條件繼續(xù)培養(yǎng)4h;加入10%HCL-SDS100μL/孔,繼續(xù)培養(yǎng)8h,測定A570值。吞噬指數計算公式:1.3.4不同濃度牛蒡紅細胞的aod用2%綿羊紅細胞免疫的小鼠,于末次給藥后24h,眼眶靜脈竇采血。將血液室溫放置1h,3000r/min離心15min分離血清,10μL血清用生理鹽水稀釋100倍。取稀釋血清1mL于試管內,依次加入0.5mL5%(體積分數)綿羊紅細胞懸液、0.5mL10%補體,在37℃下保溫30min,冰水浴終止反應。3000r/min離心10min,取上清液1mL,加都氏液3mL于試管內,同時取5%綿羊紅細胞懸液0.25mL,加都氏液至4mL,置于另一試管內,作為綿羊紅細胞的半數溶血值。充分搖勻,放置10min,于540nm處比色。以不加血清為空白對照,分別測定各管的AOD值。血清溶血素的量以半數溶血值表示,計算公式:1.3.5脾細胞懸液的制備小鼠被采血后,迅速摘取其脾臟,用冰生理鹽水沖洗干凈,配制成15mg/mL的脾細胞懸液。在試管中依次加入2%綿羊紅細胞懸液和1∶10豚鼠血清各0.5mL。另設不加補體的空白對照管,置于37℃水浴中溫育1h,3000r/min離心10min,取上清液于413nm處測定AOD值。1.4方差齊性檢驗和多重比較采用lsd采用SPSS10.0軟件包,多組均數進行方差齊性檢驗和單因素方差分析(ANOVA)和多重比較采用(LSD法),結果使用表示,顯著水平α=0.05和0.01。2結果2.1薏養(yǎng)殖大鼠的免疫能力表1數據表明,與正常組相比,模型組與給藥組小鼠體重均極顯著下降(p<0.01),表明環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠模型建立成功。飼養(yǎng)過程中還觀察到同組的雄性小鼠體重明顯低于雌性小鼠(2±1)g,皮毛稀疏,沒有光澤,精神狀態(tài)低彌;而雌性小鼠皮毛致密,光滑,精神狀態(tài)好。這種現象可能與環(huán)磷酰胺具有抑制性腺發(fā)育的作用有關。同時與模型組相比,給藥組的小鼠體重有不同程度的增加,且呈劑量依賴關系,其中高劑量組體重增加極顯著(p<0.01)。此外,模型組小鼠的免疫臟器指數極顯著下降,由正常鼠的脾臟指數(0.82±0.21)、胸腺指數(0.17±0.02)分別下降到(0.49±0.07)和(0.12±0.01)(p<0.01),說明環(huán)磷酰胺可造成小鼠免疫器官萎縮,免疫功能低下。當灌胃薏苡仁多糖后,給藥各劑量組的小鼠脾臟指數均極顯著高于模型組水平(p<0.01),并恢復甚至高于正常水平,其效果呈量效關系,提示薏苡仁多糖能明顯恢復并促進小鼠的脾臟發(fā)育,增強免疫能力。胸腺指數結果顯示:高、中劑量組的小鼠胸腺指數(0.21±0.02)、(0.17±0.02)極顯著高于模型組(p<0.01),且高劑量組的胸腺指數極顯著高于正常組的(p<0.01),中劑量組與正常組無差異,說明小鼠經薏苡仁多糖灌胃后,能有效恢復胸腺器官的發(fā)育。2.2薏養(yǎng)殖小鼠免疫功能的變化由表2可知,薏苡仁多糖具有明顯增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能,顯著提高小鼠脾臟淋巴細胞對刀豆蛋白(ConA)的增殖反應,并呈現良好的劑量效應關系。試驗結果表明:腹腔注射環(huán)磷酰胺后,模型組小鼠的脾臟淋巴細胞轉化率僅(0.99±1.4)%,極顯著低于正常小鼠(1.63±0.06)%的水平(p<0.01),說明模型組小鼠的免疫功能低下。給予不同劑量的薏苡仁多糖后,可明顯刺激脾臟淋巴細胞增殖反應,其轉化率隨薏苡仁多糖劑量的增加而呈極顯著上升(p<0.01),1000mg/(kgbwd)組的轉化率[(2.17±0.18)%]甚至極顯著高于正常組,提示薏苡仁多糖能有效調節(jié)細胞和體液的免疫應答。與正常小鼠相比,模型組小鼠的腹腔巨噬細胞吞噬指數下降明顯,從正常水平的(1.4±0.90)降低為(1.02±0.00)(p<0.05);而薏苡仁多糖各劑量組的小鼠巨噬細胞吞噬指數均較模型組顯著提高(p<0.05,p<0.01),其中低劑量組的小鼠巨噬細胞吞噬指數與正常鼠的相當,而中、高劑量組明顯高于正常鼠,表明薏苡仁多糖能有效增強小鼠的非特異性免疫功能。2.3中央層面2.714.97,2.34.535.335.325.325.325.325.325.325.325.325.335.335.325.335.335.325.325.325.335.335.335.335.335.335.335.325.335.335.325.325.335.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.32由表3可知,用2%綿羊紅細胞免疫后,模型小鼠的半數溶血值、抗體生成細胞水平顯著低于正常鼠(p<0.01),由正常鼠的(117.74±4.67),(0.590±0.03)分別下降為(63.4±4.58),(0.224±0.025)。與模型組相比,薏苡仁多糖3個劑量均極顯著地促進免疫抑制小鼠血清溶血素和抗體細胞的生成(p<0.01),并以量效效應關系分別恢復至正常小鼠的64%~90%和55%~90%,提示薏苡仁多糖對抑制小鼠體液免疫能力的恢復具有顯著的促進效果。3薏養(yǎng)殖多糖對金魚細胞免疫抑制的影響采用環(huán)磷酰胺建立的免疫抑制模型小鼠,以250,500,1000mg/(kgbwd)為低、中、高劑量的薏苡仁多糖灌胃28d進行免疫功能試驗,結果顯示:1)薏苡仁多糖可修復模型組小鼠脾臟和胸腺的免疫損傷,其中,中、高劑量給藥組小鼠的脾臟指數與胸腺指數極顯著高于模型組(p<0.01),高劑量給藥組小鼠的兩指標值極顯著高于正常組(p<0.01)。2)薏苡仁多糖有效激活巨噬細胞的吞噬功能,促進刀豆蛋白誘生的淋巴細胞增殖。薏苡仁多糖各劑量組小鼠的脾臟淋巴細胞轉化率與腹腔巨噬細胞吞噬指數均較模型組極顯著提高(p<0.01),其中,中、高劑量組均明顯高于正常鼠(p<0.01)。3)薏苡仁多糖可提高綿羊紅細胞致敏小鼠血清溶血素含量和抗體生成細胞水平(p<0.01),各劑量組小鼠的兩指標值分別恢復至正常小鼠的64%~90%和55%~90%。薏苡仁多糖是一種天然免疫促進劑,對環(huán)磷酰胺所致小鼠免疫抑制模型有良好的拮抗作用,呈現良好的量-效依賴關系。薏苡仁多糖的免疫促進作用機制可能是通過同時增強小鼠體液免疫、細胞免疫、非特異性免疫功能來共同實現。4薏養(yǎng)殖病毒的免疫作用研究免疫調節(jié)在機體中發(fā)揮著重要的作用。1974年Jerne提出著名的免疫網絡學(ImmuneNetworkTheory),其認為免疫調節(jié)是由各種免疫細胞與免疫分子相互作用構成的網絡結構,即細胞免疫、體液免疫和非特異性免疫共同構成機體的防御體系。淋巴細胞(lymphocyte)是構成免疫系統(tǒng)的基本單位,在機體細胞免疫和體液免疫應答過程中分別起著關鍵的作用。淋巴細胞轉化率反映機體細胞免疫功能的強度。巨噬細胞是除淋巴細胞外免疫系統(tǒng)中第二大主要的細胞群,在宿主的防御機制中起關鍵性的作用。巨噬細胞的吞噬能力是衡量機體非特異性免疫功能的標志之一。巨噬細胞在某些刺激因子的誘導下,可轉變?yōu)榛罨木奘杉毎?賦予其具有強大的殺傷微生物感染細胞和腫瘤細胞的能力。血清血溶素和抗體生成細胞體現體液免疫功能的強度。環(huán)磷酰胺作為一種廣譜的抗癌藥物,在殺傷癌細胞的同時也會損傷正常細胞,尤其是對機體的免疫系統(tǒng)造成損害。本試驗中,針對采用環(huán)磷酰胺建立的免疫抑制模型小鼠,以不同劑量的薏苡仁多糖進行灌胃治療。試驗結果顯示,薏苡仁多糖對環(huán)磷酰胺所致小鼠免疫抑制模型有良好的拮抗作用,可修復脾臟和胸腺的免疫損傷,激活巨噬細胞的吞噬功能,促進刀豆蛋白誘生的淋巴細胞增殖,并