gh基因多態(tài)性的pcr-sscp檢測與分析

gh基因多態(tài)性的pcr-sscp檢測與分析

采用聚合酶鏈反應反應單鏈結構多態(tài)性分析（pcr-scp）方法，研究了牧場紅足基因（gh）遺傳多態(tài)性。為確定可用于標記的分子標記，并為中國優(yōu)質特色牛提供理論基礎。1材料和方法1.1pcr擴增劑草原紅牛68頭,來自吉林省農業(yè)科學院,利用頸靜脈采血,ACD抗凝,-20℃保存,備用。TaqDNA聚合酶、dNTPs、蛋白酶K等試劑,購自北京鼎國生物技術有限責任公司;pMD-18載體試劑盒、PCR產物回收試劑盒和質粒提取試劑盒,購自寶生物工程(大連)有限公司。1.2方法1.2.1na樣品溶液利用常規(guī)的苯酚/氯仿抽提方法提取基因組DNA,用TE溶液將DNA樣品稀釋,-20℃保存,備用。用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法雙重檢測DNA的純度和濃度,然后稀釋成30ng/μL,備用。1.2.2基因序列和引物試驗所用GH引物是參照參考文獻,并根據已發(fā)表的牛GH基因(accessionnumberM57764)的堿基序列設計的,6對引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列、PCR產物大小、位置見表1。1.2.3rtaq聚合酶活性反應物體系共25.0μL,其中包括滅菌去離子水18.6μL,30.0ng/μL的DNA模板1.0μL,10×Buffer2.5μL,2.5mmol/L的dNTP1.0μL,10pmol/L的上下游引物各0.7μL,3U/μLrTaq聚合酶0.5μL。PCR反應循環(huán)參數(shù):94℃預變性5min;94℃變性30s,55～65℃復性40s,72℃延伸30～40s,35個循環(huán);最后72℃延伸10min。1.2.4聚丙烯酰胺凝膠的tbe電泳2μLPCR產物加10μL變性上樣緩沖液,98℃變性10min后,立即冰浴10min,然后上樣置于預冷的聚丙烯酰胺凝膠上。試驗根據擴增片段的大小,將30%的聚丙烯酰胺凝膠(29∶1)配成8%～12%的聚丙烯酰胺凝膠,以160V電壓于1×TBE電泳14～18h。電泳結束以后,首先在70%乙醇中固定10～15min,用去離子水洗2次,每次2～3min;銀染30min(100mL染色液中含NH3·H2O1mL,0.36%NaOH21mL,20%AgNO31.8mL),再用去離子水洗3～4次,每次2～3min,加入顯色液(200mL顯色液中含1%檸檬酸鈉1mL,甲醛100μL),待電泳條帶清晰后換上去離子水停顯。1.2.5質粒提取和測序進行PCR-SSCP分析后,將不同純合子基因型個體的PCR擴增產物在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳分離、純化回收,回收后的DNA與pMD-18載體連接,并轉化到大腸桿菌DH5α菌株中,藍白斑篩選后經PCR擴增鑒定陽性克隆,提取質粒DNA進行序列測定。2結果與分析2.1sscp分析對GH基因的內含子3進行擴增,產物經2%的瓊脂糖凝膠檢測,獲得了與目的片段大小一致的產物(345bp),帶型清晰且無雜帶,穩(wěn)定性和特異性好(見圖1),可進行SSCP分析。PCR產物經SSCP分析結果表現(xiàn)出3種基因型(見圖2)。對P1RF的兩種純合基因型AA、BB克隆測序,并用DNASTAR比對分析,結果見圖3。結果表明,在1435bp處有一個T→C的突變(與GenBankaccessionM57764相比而得),導致等位基因A變?yōu)榈任换駼;在1692處有C→T的突變(與YaoJ等1996年的研究結果相同),但并未導致新的等位基因出現(xiàn)。2.2基因型的檢測由圖4可見,在8%的聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳條件下對PCR產物進行PCR-SSCP分析,在不同個體中檢測到了3種基因型(CC、CD、DD)。對P2RF的兩種純合基因型CC、DD克隆測序,發(fā)現(xiàn)該位點在1918處有C→A的突變(與GenBankaccessionM57764相比而得),導致等位基因C變?yōu)榈任换駾,序列比拼結果見圖5。2.3和2對等位基因控制利用30%的聚丙烯酰胺配制成濃度為12%凝膠,160V電壓電泳18h,結果表明,該位點由1對等位基因控制(E、F)。對PCR產物中的純合子基因型克隆測序,由序列比較結果(見圖7)可以看出:于GH基因外顯子5的2291bp處發(fā)生了1處堿基A→C突變。2.4gh和3gh基因基因型的分析在8%的聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)、160V電泳擴增結果見圖9條件下進行PCR-SSCP分析,結果表明,在不同個體中檢測到了3種基因型,見圖10。根據PCR-SSCP結果,將GG和HH兩種純合基因型進行克隆測序,DNASTAR比對分析,發(fā)現(xiàn)在GH基因3′UTR位點2639處有C→G突變,導致等位基因由G變?yōu)镠,導致HaeⅢ增加一個酶切位點;在2735bp處有T→C(與GenBankaccessionM57764相比而得)突變,但是并未導致新的等位基因出現(xiàn)。結果見圖11。2.5sscp分析對GH基因的5′UTR片段進行PCR擴增(結果見圖12),經2%的瓊脂糖凝膠檢測,獲得與目的片段大小一致的464bpPCR產物,帶型清晰且無雜帶。PCR產物經SSCP分析結果表現(xiàn)出3種基因型(見圖13)。將P5RF位點的純合基因型II、JJ個體的PCR產物進行克隆測序,與DNASTAR比對,結果見圖14。由結果分析可見,該片段在431處有一個A到G的突變,導致等位基因由I變?yōu)镴。2.6gh基因5utrpcr-scp分析結果利用P6RF引物對5′UTRPCR擴增(結果見圖15)后,其產物進行PCR-SSCP電泳分析,結果如圖16所示。3gh基因多態(tài)性生長激素是調節(jié)動物生長發(fā)育和三大物質代謝過程的一個重要內分泌因子。bGH基因定位于19號染色體上,由5個外顯子和4個內含子組成,長約2856bp。國內外研究報道證實,GH基因遺傳多態(tài)性與牛的生長發(fā)育、屠宰和胴體性狀、泌乳和肉質性狀有不同程度的相關性。試驗以PCR-SSCP的方法,首次研究了基因全長在草原紅牛群體中的的遺傳多態(tài)性,結果發(fā)現(xiàn)在GH基因的第3內含子、第4內含子、第5外顯子的3′端和5′端存在豐富的等位基因突變。這與YaoJ等1996年的研究結果相同,但在草原紅牛群體中,并未導致新的等位基因出現(xiàn)。第4內含子在1918bp處有C→A的突變,而YaoJ等的報道則是在2017bp處堿基T→C突變,高雪等報道,在1947bp處有T→G突變,該位點的突變需要進一步探討。本試驗中GH基因外顯子52291bp處有A→C突變,與YaoJ等報道的一致。研究對草原紅牛GH基因的全基因組序列進行了多態(tài)性分析,發(fā)現(xiàn)了大量的突變位點,