楊梅果實提取物抑菌活性的研究

楊梅果實提取物抑菌活性的研究

梅西屬植物科，為楊梅科多年生多年生小樹。楊梅是原產(chǎn)中國的亞熱帶果樹之一,喜溫暖濕潤氣候,耐陰,不耐強烈日照。中國是楊梅種的原產(chǎn)地,也是主產(chǎn)區(qū),大致分布在北緯18~33°之間,東起臺灣東岸,西至云南瑞麗,北至陜西漢中,南至海南三亞,地跨北、中熱帶和北、中、南亞熱帶。經(jīng)濟栽培主要集中在東南沿海的浙江、江蘇等地。作為我國的傳統(tǒng)特產(chǎn)水果,楊梅味甘酸而性溫,有生津止渴、和胃消食、益腎利尿及消暑諸功能。明代醫(yī)學家李時珍所著的《本草綱目》中記載:“楊梅味酸甜,性溫、無毒。能止渴、和五臟、滌腸胃,除煩潰惡氣?！薄堕_寶本草》中記載:楊梅“主去痰、止嘔、斷下痢,清食解酒”。楊梅果實中含葡萄糖和果糖、維生素﹑檸檬酸、氨基酸、多種維生素、蛋白質(zhì)、脂肪、苷類等,SugaA從楊梅果實和種子中分離出2個新三萜、1個新甾體、1個新木脂素以及35個已知化合物。ZhongxiangFang等從楊梅果實中分離出了三種酚類物質(zhì)(沒食子酸、兒茶酸和櫟精三苷)和多種楊梅黃酮糖苷以及楊梅黃酮脫氧糖苷派生物。楊梅的藥用價值極高,其果實、仁、葉、皮均可入藥。我國民間歷來用酒制楊梅來止腹痛、腹瀉,確有立竿見影之功效。目前國內(nèi)外對楊梅的研究,大部分集中在楊梅的保鮮、楊梅中花色苷以及楊梅樹葉、樹皮等的研究。楊梅果實的研究僅限于成分分析、保鮮、產(chǎn)品的開發(fā)方面,對楊梅果實提取物抑菌作用的研究尚未見報道。本文詳細報道了楊梅乙醇提取物對幾種常見菌株的抑制作用,以及有關理化因素對其抗菌活性的影響,闡明了其抗菌特性,旨在能開發(fā)出一種天然的食物防腐劑,同時也為楊梅的深度利用開辟一條新途徑。1材料和方法1.1菌株與培養(yǎng)基新鮮的大浮楊梅:無錫馬山。大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)、溶血性鏈球菌(Streptococcushaemolyc)、志賀氏痢疾桿菌(Shigelladysenteriae)、黑曲霉(Aniger)均由無錫市疾病預防與控制中心提供。細菌以營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進行斜面活化,霉菌以馬鈴薯培養(yǎng)基進行斜面活化。PYX-DHS-40-50-BS隔水式恒溫培養(yǎng)箱,R-501旋轉蒸發(fā)器,HYG-II回轉式恒溫調(diào)速搖瓶柜,LS-B50型立式圓形壓力蒸氣滅菌器,DELTA-320pH計,W-501升降恒溫水浴鍋。1.2楊樹莓原汁的制備將購買的新鮮楊梅洗凈、瀝干,稱量相同質(zhì)量(300g/份)的楊梅分裝,分別加入相同體積(1L)的95%的乙醇溶液浸泡6個月以上,浸提液經(jīng)過抽濾,旋轉蒸發(fā)(55℃,80r/min),將得到的濃縮液定容至1g/mL,置于冰箱中保存,作為待測液,即楊梅粗提物濃度為1g/mL,即每毫升提取物中含有原料楊梅1g。本文中涉及的楊梅果實乙醇提取物的濃度均按此定義。1.3菌種細菌從斜面挑取菌株,細菌經(jīng)37℃/24h,霉菌經(jīng)28℃/24h恒溫搖瓶培養(yǎng)(180r/min),然后菌液用無菌生理鹽水稀釋成10-1、10-2、10-3等不同濃度梯度的菌液,各吸取1mL分別加入已滅菌冷卻的平面培養(yǎng)基中涂布均勻后培養(yǎng)(細菌:37℃/24h;霉菌:28℃/24h),根據(jù)觀察結果選取適宜的菌液濃度。1.4抗菌特性的測定1.4.1養(yǎng)基、培養(yǎng)基的制備用管碟法。取無菌培養(yǎng)皿(直徑90mm、高18mm,大小一致,皿底平坦)20套,每皿加入融化的20mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為底層,凝固。用滅菌的微量移液槍移取0.1mL菌液(菌液濃度1×106~6×106cfu/mL)加入上述已倒好平皿的培養(yǎng)基中,涂布均勻,待凝固后每平板等距離放置3個滅菌牛津杯(內(nèi)徑6mm,外徑8mm,高10mm),將上述提取液200μL加入牛津杯,每個菌種做5組平行,以無菌生理鹽水為對照。按1.3所述條件培養(yǎng),量取抑菌圈直徑,記錄結果。1.4.2菌懸液的制備用試管連續(xù)二倍稀釋法:將10支滅菌試管排成一列、編號,各加入滅菌普通肉湯1mL,在第1管內(nèi)加入1g/mL的提取物1mL,混勻后吸取1mL到第2管,混勻再取1mL到第3管,依次類推到第9管,棄去1mL,第10管不加提取物,然后每管加入菌液0.1mL(菌懸液106cfu/mL),混勻,置37℃恒溫培養(yǎng)24h。結果判定:肉湯清亮透明表示無細菌生長(-),肉湯渾濁表示有細菌生長(+),以能抑制細菌生長的楊梅提取物最高稀釋度作為其最低抑菌濃度(MIC)。以生理鹽水作對照。1.4.3微生物培養(yǎng)平板將1.2所述提取物分裝在5個無菌三角瓶中,經(jīng)70℃/30min、80℃/20min、90℃/10min、100℃/5min處理,冷卻后待用。采用平板菌落計數(shù)法,制成含楊梅提取物的微生物培養(yǎng)平板(提取物與培養(yǎng)基體積比為1∶10,菌液濃度103~104cfu/mL),以無菌生理鹽水做對照實驗。37℃下恒溫培養(yǎng)24h后,觀察平板中菌落的生長情況并計數(shù),分別測定抑菌率:1.4.4不同ph值對實驗動物的微生物培養(yǎng)平板調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值,制成pH值分別為5、6、7、8的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。用平板菌落計數(shù)的方法,制成含楊梅提取物的不同pH值環(huán)境的微生物培養(yǎng)平板(同1.4.3),凝固后置于恒溫箱中培養(yǎng)(37℃,24h)。以無菌生理鹽水為實驗對照。37℃下恒溫培養(yǎng)24h后,觀察平板中菌落的生長情況并記數(shù),分別測定抑菌率(同1.4.3)。1.4.5成糖液和成液平板的制作選取志賀氏痢疾桿菌為供試菌株,分別向培養(yǎng)基中添加0、10%、20%、50%的蔗糖,制成含不同糖濃度、含有提取物的微生物培養(yǎng)平板(同1.4.3),同時以無菌生理鹽水做對照。37℃下恒溫培養(yǎng)24h后,觀察平板中菌落的生長情況并計數(shù),分別測定抑菌率(同1.4.3)。1.4.6與鹽的結合可以預防和污染選取志賀氏痢疾桿菌為供試菌株,分別向培養(yǎng)基中添加0、3%、5%、10%的NaCl,其余同1.4.5。2結果與分析2.1抑菌圈和抑菌圈從表1可看出,楊梅果實提取物對金黃色葡萄球菌、志賀氏痢疾桿菌、溶血性鏈球菌和傷寒沙門氏菌具有良好的抑菌作用,抑菌圈大小:溶血性鏈球菌>金黃色葡萄球菌>志賀氏痢疾桿菌>傷寒沙門氏菌,而對大腸桿菌和黑曲霉幾乎沒有抑菌作用。2.2總體抑菌能力各樣品試管與對照試管相比較,可以明顯看出試管內(nèi)肉湯培養(yǎng)基的渾濁度,試驗結果(表2)表明,隨著楊梅提取物濃度的增加,抑菌能力也增加,楊梅粗提物對各菌株的最低抑菌濃度分別為:金黃色葡萄球菌0.031g/mL,志賀氏菌和沙門氏菌為0.125g/mL,鏈球菌為0.062g/mL。2.3加熱預處理對抗菌效果的影響從圖1可看出,楊梅提取物對預處理溫度以及時間的長短不敏感,基本沒有大的影響,說明提取物對熱具有良好的穩(wěn)定性。2.4ph值對抑菌效果的影響結果顯示(圖2),pH值對楊梅果實提取物的抑菌能力具有較大的影響,隨著pH值的降低,抑菌效果顯著增強,在pH5時,幾乎對每種供試菌的抑制率都達到了95%以上,特別對金黃色葡萄球菌的抑制作用。2.5鹽、糖的添加量在含鹽、糖的溶液里,楊梅果實提取物的抑菌作用明顯加強(圖3、圖4),添加的鹽、糖的濃度越大,抑菌率也隨之增大,這表明楊梅果實提取液與鹽、糖有較強的協(xié)同作用,其作用機理應該與鹽、糖本身也是食品防腐劑有關。3總體抑菌活性實驗證明,楊梅果實粗提物對常見致病菌金黃色葡萄球菌、志賀氏痢疾桿菌、溶血性鏈球菌和傷寒沙門氏菌具有良好的抑菌作用,最低抑菌濃度(MIC)分別為0.031g/mL(金黃色葡萄球菌)、0.125g/mL(志賀氏菌)、0.125g/mL(沙門氏菌)、0.062g/mL(鏈球菌);楊梅乙醇提取物對熱具有良好的穩(wěn)定性,與鹽、糖具有良好的協(xié)同抑菌作用,另外提取物的抑菌活性受pH的影響較大,其抑菌活性隨著pH值的降低而提高。植物是生物活性化合物的天然