鎖陽多糖的體外清除自由基作用研究

鎖陽多糖的體外清除自由基作用研究

鎖陽是鎖定科植物的根生物。它生長在沙子和多沙地區(qū)，并與原始刺科植物混合在一起。鎖陽在中、蒙藥中是常用藥,具補(bǔ)腎、助陽、益精、潤腸之功效。對(duì)鎖陽多糖的抗氧化性研究較少。結(jié)合鎖陽多糖提取工藝的研究和多糖的研究進(jìn)展,本次實(shí)驗(yàn)采用不同溫度對(duì)鎖陽中多糖進(jìn)行水溶醇沉法提取,觀察浸提溫度對(duì)鎖陽多糖清除羥自由基(·OH)和超氧自由基(O2-·)活性的影響,以期為鎖陽在醫(yī)藥、營養(yǎng)及保健食品中的應(yīng)用提供一定的理論參考。1材料和方法1.1精密科學(xué)檢測鎖陽的干燥肉質(zhì)莖:于2001年1月采自張掖市紅沙窩,采后避光陰干。苯酚、硫酸、硫酸亞鐵、雙氧水、鹽酸、鄰二氮菲、鄰苯三酚等均為分析純。電子天平:MettlerToledo,0.01mg/200g;7230G型分光光度計(jì)、752N型紫外可見分光光度計(jì):上海精密科學(xué)儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋:上海滬南科學(xué)儀器廠。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1粗多糖的制備將避光陰干的鎖陽肉質(zhì)莖粉碎后,按一定的料液比(鎖陽粉∶蒸餾水=1∶15)混合后,分別在90、65、35℃下水浴浸提2h,浸提液離心后,殘?jiān)鼦壢?取上清液加入95%乙醇溶液,使溶液中含醇量達(dá)到80%,放置過夜后離心,沉淀物用80%的乙醇洗滌兩次后得粗多糖。然后稱取1.00g粗多糖用蒸餾水定至50mL的容量瓶中,待測備用。1..2.2.固陽厚葡萄糖含量測定1.2.3feo4/h3參考方法略作改動(dòng):取1.5mL5×10-3mol/L鄰二氮菲,加2.0mLpH為7.4的PBS緩沖液充分搖勻混合,加1.0mL7.5×10-3mol/LFeSO4溶液,每加一管立即搖勻,加1.0mL3%(體積比)H2O2,最后用重蒸水補(bǔ)至10mL。在37℃水浴條件下反應(yīng)1h,然后在536nm波長下測定吸光度A536(損傷)。同上法,加鎖陽多糖之后加H2O2,測定A536(加藥),同上法,不加入H2O2和鎖陽多糖測定A536(未損傷)。表觀羥自由基清除率E%計(jì)算方法如下:實(shí)驗(yàn)平行測定3次。1.2.4清除清除劑清除自由基活性的測定在堿性條件下(pH8.2),鄰苯三酚發(fā)生自氧化反應(yīng),生成O2-·和有色中間產(chǎn)物,該有色物在325nm處有一特征吸收峰。當(dāng)加入O2-·清除劑時(shí),O2-·的生成受到抑制,鄰苯三酚的自氧化反應(yīng)受阻,溶液在325nm處吸收峰減小。故通過測定A325值可以定量判斷自氧化反應(yīng)的程度,并可以計(jì)算出清除劑的清除率。實(shí)驗(yàn)方法按參考文獻(xiàn)略有改動(dòng):取4.5mL150mmol/mL的pH為8.2的HCl-Tris緩沖液于10mL棕色容量瓶中,置于25℃水浴中10min,然后加入不同濃度的樣液,再立即加入1mL10×10-3mol/L的鄰苯三酚,混合后在30s內(nèi)用蒸餾水定溶至10mL,最后在25℃水浴中反應(yīng)4min,立即用8mol/L的HCl2滴終止反應(yīng),并在325nm處測吸光度A325。每一個(gè)濃度做一個(gè)相對(duì)應(yīng)樣品的消除實(shí)驗(yàn),其過程為:取HCl-Tris緩沖液4.5mL于試管中,置于25℃水浴中預(yù)熱10min,加2滴HCl后,迅速加入樣品液,再加入鄰苯三酚1mL,在30s內(nèi)用蒸餾水定容至10mL。觀察不同溫度提取下鎖陽多糖對(duì)鄰苯三酚自氧化的抑制作用,抑制率計(jì)算公式為:O2-·抑制率I(%)=A自氧化-(A樣品-A樣品消除)/A自氧化×100實(shí)驗(yàn)平行測定3次。2結(jié)果2.1提取溫度對(duì)多糖清除率的影響從表1可見,鎖陽多糖對(duì)·OH的清除率隨著提取溫度的降低達(dá)到清除率50%的所需多糖濃度逐漸變小,在同一提取溫度下隨著多糖濃度的增加清除率呈指數(shù)或?qū)?shù)形式依次增大,由此說明,鎖陽多糖對(duì)·OH的清除作用受提取溫度的影響較顯著,而濃度對(duì)清除率的影響次之。2.2多糖對(duì)不同溫度下多糖抑制率的影響從表2可見,在同一提取溫度下鎖陽多糖對(duì)超氧陰離子(O2-·)的抑制率隨著多糖濃度的增加清除呈對(duì)數(shù)形式增長,在不同溫度下,達(dá)到50%抑制率時(shí)所需濃度隨溫度的減小而顯著減小。由此說明,鎖陽多糖對(duì)超氧自由基(O2-·)的抑制作用受多糖提取溫度影響更為顯著,而濃度的影響其次。2.3相同濃度的鎖陽糖在不同提取溫度下對(duì)自由基進(jìn)行去除從圖1可見,在同一濃度不同提取溫度下的鎖陽多糖對(duì)·OH和O2-·清除和抑制作用隨溫度的降低而升高。3提取溫度對(duì)鎖陽多糖抗氧化活性的影響采用苯酚-硫酸比色法測得在90、65、35℃下提取的待測備用溶液中鎖陽多糖含量分別為32.5、21.76、13.6mg/mL,90、65、35℃下多糖的提取率分別為9.34%、5.71%、1.86%。在不同提取溫度下的鎖陽多糖對(duì)·OH和O2-·均有良好的清除作用。在90、65、35℃下,對(duì)·OH的清除率達(dá)到50%時(shí)所需多糖濃度分別為1.28、0.484mg/mL和0.155mg/mL;對(duì)O2-·的抑制率達(dá)到50%時(shí)所需多糖濃度分別為0.72mg/mL、0.339mg/mL和0.086mg/mL。由此可見,相同溫度提取下的鎖陽多糖在相同清除率或抑制率時(shí)清除·OH所需多糖濃度較抑制O2-·所需濃度大,而且提取溫度越低提取的粗多糖對(duì)自由基的清除效果越好,這可能與低溫下提取粗多糖攜帶的其他成分的協(xié)同作用有關(guān)或與低溫更有利于多糖活性成分的保持有關(guān)。在同一提取溫度下鎖陽多糖隨著濃度的增加,對(duì)·OH和O2-·的清除和抑制作用依次呈對(duì)數(shù)形式增大。在不同提取溫度下同一濃度的鎖陽多糖對(duì)·OH和O2-·清除作用隨溫度降低反而升高。由此表明,溫度對(duì)鎖陽粗多糖抗氧化的活性有顯著的影響,這可能與提取物中多糖的成分、結(jié)構(gòu)有密切的關(guān)系。粗多糖一般由糖類、蛋白質(zhì)、果膠和灰分等物質(zhì)組成。由于多糖中存在蛋白質(zhì),且多糖與蛋白質(zhì)呈緊密結(jié)合態(tài),進(jìn)而影響蛋白質(zhì)活性的任何因素都會(huì)影響多糖的活性。一般情況下多糖的活性隨溫度的升高而增加,但當(dāng)溫度高到一定程度時(shí)因使蛋白變性而活性喪失。一般糖蛋白活性的最適溫度為45℃,因此,提取溫度很大程度上影響著鎖陽多糖的活性。從實(shí)驗(yàn)可以看出,35℃的影響較小,而90℃的影響最大。由于溫度對(duì)鎖陽多糖的活性和提取率有較顯著的影響,由此在65℃下提取的鎖陽多糖應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值相對(duì)較高。4鎖陽粗多糖的清除自由基的篩選衰老的自由基學(xué)說引起人們的廣泛重視,當(dāng)活性氧在體內(nèi)的代謝失衡時(shí),將導(dǎo)致氧自由基增多,進(jìn)而誘發(fā)一系列的機(jī)體損傷過程,從而導(dǎo)致人體器官的衰老。因此,國內(nèi)外許多學(xué)者正在積極從事具有清除自由基的篩選工作。大量研究發(fā)現(xiàn)多糖具有復(fù)雜的、多方面的