成熟液添加egf和-基乙醇對綿羔羊卵母細(xì)胞的影響

成熟液添加egf和-基乙醇對綿羔羊卵母細(xì)胞的影響

juveniemi傳記transzer，juveniet）是一個(gè)集幼牛超聲卵、卵母細(xì)胞外成熟、體外受精、卵外培養(yǎng)和胚胎移植技術(shù)于一體的先進(jìn)生物技術(shù)體系。利用幼畜體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)能夠獲得大量卵母細(xì)胞,充分利用優(yōu)良母畜的遺傳資源,縮短世代間隔,加快育種進(jìn)程。然而,幼畜卵母細(xì)胞核成熟和質(zhì)成熟不充分,卵母細(xì)胞異常受精率高于成年動(dòng)物。這些問題造成幼畜卵母細(xì)胞體外囊胚率低,胚胎移植后代出生率低。目前,幼畜體外胚胎生產(chǎn)大多采用成年動(dòng)物的體外胚胎生產(chǎn)體系,導(dǎo)致幼畜體外胚胎生產(chǎn)效率普遍較低。因此,需要進(jìn)一步研究幼畜卵母細(xì)胞體外成熟、體外受精和體外發(fā)育,不斷完善幼畜胚胎體外生產(chǎn)體系,提高幼畜卵母細(xì)胞生產(chǎn)體外胚胎的效率。為優(yōu)化綿羔羊卵母細(xì)胞體外成熟條件,筆者比較了不同濃度的表皮生長因子(EGF)和β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol)對綿羔羊卵母細(xì)胞受精情況、卵裂率和囊胚率的影響,并與成年羊卵母細(xì)胞進(jìn)行了比較。1材料和方法1.1材料表面1.1.1成年羊卵粒采集挑選生長發(fā)育良好的4～8周齡母綿羔羊進(jìn)行超數(shù)排卵,手術(shù)后注射器活體采卵;成年羊卵巢采自新疆石河子市牛羊定點(diǎn)屠宰場。冷凍精液為實(shí)驗(yàn)室自制的綿羊顆粒凍精。1.1.2藥品、試劑和儀器M199(Gibco-31100-03)、FSH(Vetrepharm,Canada,1-800-032-355)、LH和PMSG(寧波市三生藥業(yè))、四孔板(NUNC,109199)和培養(yǎng)皿(NUNC,113973)。試劑除特別指明外,均SIGMA公司藥品。發(fā)情羊血清(ESS)為實(shí)驗(yàn)室自制。從發(fā)情1.5d的母羊頸靜脈采集血液,室溫下靜置12h左右,取上清液,56℃水浴滅活30min,用0.22μl濾器過濾后分裝,-20℃冷凍保存。1.2卵母細(xì)胞的收集參照Kelly等的方法進(jìn)行羔羊激素處理。將處理后的羔羊打開腹腔,將卵巢引到腹腔外,用含有2ml吸卵液(M199原液+25mmol/LHEPES+0.2%BSA+100mg/LHeparin)的20G針頭一次性注射器活體吸取卵泡中的卵母細(xì)胞。在體式顯微鏡收集A、B級卵子。統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞數(shù)量。成年羊卵巢從屠宰場采集后,用同樣規(guī)格注射器活體采卵。1.3成熟液濃度的確定將收集卵母細(xì)胞在成熟液(空白組:M199原液+10%ESS+10μg/mlFSH+10μg/mlLH+1μg/mlE2)中洗1～2遍后分別移入在培養(yǎng)箱中平衡2h的50μl成熟液微滴中,每滴10～20枚卵母細(xì)胞,38.5℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)24h。成熟液成分:成熟液Ⅰ為空白組中分別加入10、50、100ng/ml的EGF;成熟液Ⅱ?yàn)榭瞻捉M中分別加入50、100、200μmol/L的β巰基乙醇;成熟液Ⅲ為空白組中加入最優(yōu)濃度的EGF和β巰基乙醇。1.4u3000naclamine+0.1motaurin+10g/mlas-5.3.4和10.違規(guī)元素l.4e的滴中卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)24h后,輕輕吹打除去部分顆粒細(xì)胞,移入平衡2h的40μl受精液(SOF+0.2μmol/LPenicillamine+0.1μmol/LHypotaurine+10μg/mlHeparin+10%ESS)滴中,每滴20枚。冷凍顆粒精液在39℃水浴中解凍后采用Percoll梯度(45%和90%)離心法收集活力較好的精子,稀釋成5×106/ml。將10μl精子稀釋液移入受精液滴中。置于38.5℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中受精18h。1.5體外培養(yǎng)體外培養(yǎng)輕輕吹打受精的卵母細(xì)胞除去顆粒細(xì)胞和周圍精子,在胚胎發(fā)育液(SOF+2%BME(EAA)+1%MEM(NEAA)+0.1mmol/LGlutamine+0.5mg/mlMys-Inositol+0.8%BSA)中清洗1～2次后,以15～20枚/50μl的密度移入已經(jīng)平衡2h的發(fā)育液滴中,在飽和濕度的培養(yǎng)箱中,38.5℃、5%CO2進(jìn)行體外培養(yǎng)。從受精開始計(jì)時(shí),48h統(tǒng)計(jì)卵裂率,第6～8天統(tǒng)計(jì)囊胚率。1.6正常生殖中未紅色凝膠原核的檢測將體外受精18h后的卵母細(xì)胞在透明質(zhì)酸酶輕輕吹打,除去表面的顆粒細(xì)胞。移到四孔板內(nèi)固定液(無水乙醇∶冰醋酸,3∶1,4℃)中固定24h后,載玻片上預(yù)覆蓋蓋玻片四角的位置涂上石蠟凡士林混合物。將卵母細(xì)胞和少量固定液一起移到載玻片上,然后用蓋玻片輕輕壓片固定住卵母細(xì)胞,使用1%地衣紅染色9min,脫色液(純水∶醋酸∶甘油=3∶1∶1)脫去染色液,然后置于相差顯微鏡下觀察細(xì)胞核狀態(tài)。雙原核為正常受精卵;單原核或無原核為未受精卵;多原核(n≥3)為多精入卵,如圖1所示。1.7數(shù)據(jù)處理和分析用卡方檢驗(yàn)χ2進(jìn)行差異顯著性分析。2結(jié)果與分析2.1組患兒各局部點(diǎn)囊胚率的比較由表1可知,空白組羔羊卵母細(xì)胞卵裂率為63.7%,各濃度EGF組羔羊卵母細(xì)胞卵裂率分別為66.4%、65.5%和64.3%,4組之間差異不顯著(P>0.05),但均顯著低于成年羊組(77.3%,P<0.05)?？瞻捉M囊胚率為10.5%,低于各濃度EGF組囊胚率(12.0%、12.8%和12.7%),但差異不顯著(P>0.05);空白組和各濃度EGF組囊胚率顯著低于成年羊組(30.5%,P<0.05)。2.2各濃度-基乙醇對大鼠囊胚率的影響由表2可知,空白組羔羊卵母細(xì)胞卵裂率(64.2%)和各濃度β-巰基乙醇組羔羊卵母細(xì)胞卵裂率(65.6%、68.2%和67.8%)差異不顯著(P>0.05),但仍顯著低于成年羊組(77.3%,P<0.05);空白組囊胚率(9.8%)顯著低于100μmol/Lβ-巰基乙醇組(19.3%,P<0.05),與其他濃度β-巰基乙醇組差異不顯著(P>0.05);各濃度β-巰基乙醇組囊胚率差異不顯著(P>0.05);空白組和各濃度β-巰基乙醇組均顯著低于成年羊組(31.0%,P<0.05)。2.3兩組不同時(shí)點(diǎn)分布比較,見表1由表3可知,成年羊組和β-巰基乙醇組的正常受精率分別為79.7%和74.5%,差異不顯著(P>0.05),但顯著高于空白組(62.2%,P<0.05)。空白組多精入卵率(17.8%)顯著高于成年羊組(8.0%,P<0.05),成年羊組和β-巰基乙醇組(12.0%)之間差異不顯著(P>0.05)。空白組未受精率(20.0%)高于成年羊組(12.3%)和β-巰基乙醇組(13.5%),但差異不顯著(P>0.05)。3成熟液中添加ndf對牛卵母細(xì)胞的影響3.1成熟液中添加EGF對羔羊卵母細(xì)胞卵裂率和囊胚率的影響表皮生長因子(EGF)是一種由53個(gè)氨基酸殘基組成的多肽物質(zhì),EGF與細(xì)胞表面的EGF受體(EGFR)結(jié)合,引起EGFR二聚體形成、酪氨酸激酶迅速激活以及酪氨酸自動(dòng)磷酸化,并導(dǎo)致信號傳導(dǎo)途徑中作為第二信使的特異性基質(zhì)蛋白磷酸化,由此調(diào)節(jié)有絲分裂以及其他細(xì)胞活動(dòng)。EGF存在于機(jī)體多種組織中,在卵巢上卵泡和基質(zhì)中均有表達(dá)。研究表明,EGF受體存在于未成熟卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs),EGF能促進(jìn)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂。EGF能誘導(dǎo)卵母細(xì)胞的成熟,在無血清的成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)小鼠、牛、豬和人卵母細(xì)胞均能促進(jìn)卵母細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)成熟。Lonergan等研究表明,在無血清的成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)牛卵母細(xì)胞,添加EGF能顯著提高卵母細(xì)胞成熟率、卵裂率和囊胚率,且對裸卵的成熟也有促進(jìn)作用,但在含血清的成熟培養(yǎng)液中則不會有所提高。EGF能誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞擴(kuò)散,促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟。Park等研究表明,在無血清成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng),能提高牛卵母細(xì)胞受精率和囊胚率,但不能提高囊胚細(xì)胞數(shù)。該研究中成熟液中加入不同濃度EGF對羔羊卵母細(xì)胞卵裂率和囊胚率均無明顯影響,這與上述報(bào)道的結(jié)果有所不同。這可能是因?yàn)槌墒煲褐屑尤肓税l(fā)情羊血清(ESS),而ESS里可能含有EGF或某些能替代EGF的物質(zhì),這需要對ESS具體成分做進(jìn)一步研究。幼畜卵母細(xì)胞發(fā)育能力顯著低于成年動(dòng)物。目前普遍認(rèn)為幼畜卵母細(xì)胞發(fā)育能力低是由于細(xì)胞質(zhì)發(fā)育不成熟所致,也有報(bào)道認(rèn)為是細(xì)胞核不成熟所致。該研究中羔羊卵母細(xì)胞發(fā)育能力仍顯著低于成年羊,這需要進(jìn)一步對幼畜卵母細(xì)胞核質(zhì)發(fā)育機(jī)制進(jìn)行研究。3.2成熟液中添加β-巰基乙醇對羔羊卵母細(xì)胞受精情況、卵裂率和囊胚率的影響活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS),如超氧負(fù)離子(O2-)、羥自由基(OH-)和過氧化氫(H2O2)等,是細(xì)胞內(nèi)代謝過程中產(chǎn)生的一類含氧產(chǎn)物。研究表明,低濃度ROS能促進(jìn)配子的相互作用。但更多的試驗(yàn)表明ROS在體外胚胎生產(chǎn)中是不利的。ROS的這些不利影響包括:降低精子的活力、導(dǎo)致染色體蛋白的氧化磷酸化、阻滯卵裂并造成胚胎的發(fā)育能力的下降等。與體內(nèi)胚胎發(fā)育相比,體外胚胎培養(yǎng)會導(dǎo)致ROS含量升高。ROS能透過細(xì)胞膜并造成細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)、蛋白和核酸等分子的結(jié)構(gòu)改變,這些將會影響胚胎早期的發(fā)育。在體內(nèi),細(xì)胞通過ROS清除劑(抗氧化劑)中和ROS的不利影響。然而,由于沒有體內(nèi)抗氧化劑的保護(hù),體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞和胚胎時(shí)抗氧化劑的含量低于體內(nèi)。因此,需要向培養(yǎng)基中加入抗氧化劑或抗氧化劑前體,這將對體外卵母成熟和胚胎發(fā)育起到非常重要的作用。谷胱甘肽(GSH)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞抗氧化損傷方面具有重要作用。在成年動(dòng)物卵母細(xì)胞中,GSH含量的增加發(fā)生在卵母細(xì)胞排卵前,而幼畜卵母細(xì)胞合成GSH的能力又顯著低于成年動(dòng)物。受精后,GSH參與卵母細(xì)胞的激活和精子的解聚以及受精精子頭轉(zhuǎn)化為雄原核。因此,成熟液中添加含巰基化合物(GSH前體物質(zhì),如胱氨酸、半胱氨酸、半胱胺和β-巰基乙醇等)能夠提高細(xì)胞質(zhì)中GSH的濃度,保護(hù)卵母細(xì)胞以及精子免受ROS的氧化損傷,提高卵母細(xì)胞的成熟率和胚胎的發(fā)育能力。該研究中向成熟液中添加100μmol/Lβ-巰基乙醇能顯著提高羔羊卵母細(xì)胞正常受精比例,多精入卵比例也明顯下降,且正常受精的比例與成年羊沒有顯著差異。這說明卵母細(xì)胞中合成的GSH在一