荒漠肉蓉、鎖陽和黃花列當的dna分子鑒別

荒漠肉蓉、鎖陽和黃花列當的dna分子鑒別

生物渣諾，又名小禹、甜禹、榮榮、甜禹、地精等，是中國傳統(tǒng)的稀有中藥。具有益腎陽、益血潤腸排便的功效。主要用于陽痿、妊娠、腰膝酸軟、肌肉和大便松弛。其應用始載于《神農本草經》,被列為上品藥材。其在歷代增力中藥處方中出現率最高,同時在抗衰老類方劑中的出現率僅次于人參,居于第2位,故其具有“沙漠人參”的美譽。2000年版《中國藥典》之前規(guī)定的藥材肉蓯蓉來源為列當科植物荒漠肉蓯蓉CistanchedeserticolaY.C.Ma的干燥帶鱗葉的肉質莖。但是近年來,由于野生肉蓯蓉資源已瀕臨枯竭,肉蓯蓉及寄主梭梭已被列為國家二級保護植物,同時也被列入瀕危動植物種國際貿易公約(CITES)。因此,從2005年版《中國藥典》開始,將荒漠肉蓯蓉與資源較豐富的管花肉蓯蓉C.tubulosa(Schenk)Wight共同作為肉蓯蓉藥材的基原植物。近年來,由于中醫(yī)藥事業(yè)的大力發(fā)展,導致肉蓯蓉需求量大增,貨源短缺,目前,市場上肉蓯蓉的售價大約125元/kg,列當類藥材大約30元/kg,鎖陽大約15元/kg,因此,在巨大利益的趨勢下,市場上常發(fā)現將黃花列當或者鎖陽摻雜其中冒充肉蓯蓉的現象。其中黃花列當OrobanchepycnostachyaHance.為列當科列當屬植物,全草入藥,具有補腎助陽、強筋骨的功能;鎖陽CynomoriumsongaricumRupr.為鎖陽科鎖陽屬植物,具有補腎、助陽、益精、潤腸的作用。肉蓯蓉,黃花列當及鎖陽3種藥材經過加工后性狀較為相似,雖也同為補陽藥,但在性味、歸經、功能主治不盡相同。因此,建立一種用于快速、準確鑒別肉蓯蓉藥材的方法對于保障人民用藥安全以及規(guī)范肉蓯蓉市場的流通具有重大意義。肉蓯蓉藥材鑒別的方法較多,包括原植物鑒別、性狀鑒別和顯微鑒定以及理化鑒別等,但這些鑒別手段常常受到人為或環(huán)境因素的影響。與之相比,分子標記技術因具有穩(wěn)定、不受器官和環(huán)境因素影響的特點。目前已報道的肉蓯蓉分子鑒別方法是采用DNA條形碼通用基因片段ITS2和psbA-trnH,通過基于對序列差異分析來達到肉蓯蓉藥材的真?zhèn)舞b別,但是該鑒別方法繁瑣并周期時間長(包括擴增,測序,序列分析等),導致不能滿足實際需求,因此急需建立穩(wěn)定、簡單、快捷、通用性好的分子鑒別方法。近年來,位點特異性PCR方法已成功用于人參,金銀花,黃芪等中藥材的真?zhèn)舞b別,因此本研究通過位點特異性PCR方法對荒漠肉蓯蓉及其混偽品鎖陽和黃花列當進行鑒別研究,并嘗試對真?zhèn)位靷纹愤M行鑒別探索,為肉蓯蓉藥材的鑒別提供更符合實用要求和簡單快捷的方法。1材料表面2方法2.1pcr擴增dntps取100mg干燥材料,使用CTAB法提取總DNA。取不同樣品DNA,終濃度大約為50mg·L-1,使用通用引物ITS1和ITS4進行PCR反應以檢測模板DNA質量。PCR反應體系總體積為25μL,包括2.5μL10×ExTaqbuffer緩沖液,2μL(10mmol·L-1)dNTPS,引物各0.25μL(10pmol·L-1),ExTaq酶0.2μL(5U·μL-1),DNA1μL,滅菌蒸餾水19.8μL。PCR反應液配制完后,輕輕震蕩混勻,將PCR管放入PCR儀進行PCR反應,反應程序見表2。取3μL擴增產物,并加入3μL6×loadingbuffer,通過1%的瓊脂糖凝膠電泳,并用EB染色觀察。陽性結果的PCR產物由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司北京分公司測序部測序,各樣品均采用正向和反向測序,以保證測序的準確性。2.2序列分析處理將3種藥材荒漠肉蓯蓉,黃花列當以及鎖陽的51個個體的ITS序列進行比對分析,所得DNA序列用CONTIG軟件同源對齊,并輔以人工校對。排序后的序列使用BioEdit分析軟件進行分析處理。用MEGA4.0軟件對各樣品ITS序列的差異性進行分析,并采用鄰接法(NJ法)構建系統(tǒng)發(fā)育樹,并以Bootstrap作1000次可信度分析,且cutoff取不小于50%。2.3ssr系統(tǒng)引物篩選用BioEdit分析軟件對ITS序列進行分析、多重比對,找出具有穩(wěn)定差異的變異位點,篩選獲得變異位點,通過該位點利用PrimerPremier5.0軟件設計一對用于荒漠肉蓯蓉鑒別的特異引物CD_1F/CD_1R,設計的特異引物擴增后片段大小為331bp,引物序列見表2。2.4pcr反應總dna提取取荒漠肉蓯蓉,鎖陽和黃花列當不同樣品的DNA進行位點特異性PCR,PCR反應體系為2.5μL10×ExTaqbuffer緩沖液,2μL(10mmol·L-1)dNTPs,特異鑒別引物各0.25μL(10pmol·L-1),ExTaq酶0.2μL(5U·μL-1),DNA1μL,滅菌蒸餾水19.8μL,反應程序見表2。反應結束后,取3μL擴增產物,并加入3μL6×loadingbuffer,通過1%的瓊脂糖凝膠電泳,并用EB染色觀察。另外,為獲得最優(yōu)的位點特異性PCR反應條件,對其反應條件進行優(yōu)化,分別考察了退火溫度,PCR循環(huán)數、引物濃度、dNTP用量對PCR反應穩(wěn)定性的影響。3結果和結論3.1系統(tǒng)樹絡聚類分析本實驗使用通用引物ITS1-ITS4對不同樣品進行擴增,將擴增產物測序,得到ITS序列,ITS序列在所有樣品內變化不大,長度為686~699bp,見圖1。采集NJ法構建系統(tǒng)發(fā)育樹,見圖2。方法采用Kimura2-parameter距離,系統(tǒng)樹各分支的置信度用bootstrapmethod檢驗,共進行1000次循環(huán),以評價分支的統(tǒng)計學意義與可靠性。從圖2可以來看,通過構建NJ法建立系統(tǒng)樹進行聚類,所有的樣品分為3大支:荒漠肉蓯蓉樣品聚為一支,黃花列當樣品聚為一支,鎖陽樣品聚為一支,區(qū)分的可信度為99%。從系統(tǒng)樹分支上顯示荒漠肉蓯蓉和黃花列當的遺產關系較近,與鎖陽遺產關系較遠,這符合植物的形態(tài)分類學的分類結果。通過系統(tǒng)樹聚類分析可將荒漠肉蓯蓉和黃花列當及鎖陽有效鑒別開。結果表明ITS序列可以用于鑒別肉蓯蓉與其混偽品,ITS序列分析可見能夠成為肉蓯蓉與其混偽品鑒別分析的有效手段。3.2pcr檢測結果利用位點特異性PCR方法對設計的特異引物進行驗證,實驗結果顯示通過利用肉蓯蓉位點特異PCR引物對所有51個實驗樣品進行PCR擴增:只有荒漠肉蓯蓉樣品能擴增出331bp的片段,而混偽品黃花列當和鎖陽樣品不會擴增出任何條帶,部分結果見圖1。實驗結果可見該位點特異引物可在同一PCR反應中鑒別正品肉蓯蓉和其混偽品黃花列當和鎖陽,所以該引物可以作為肉蓯蓉及其混偽品黃花列當和鎖陽的鑒別引物。3.3不同條件對鑒別pcr的影響在位點特異引物中,人為的引入了錯配位點,因此PCR擴增條件對實驗結果有著較大的影響,并將直接影響到鑒別結果的準確性和穩(wěn)定性。為此本研究對PCR循環(huán)數、退火溫度、引物濃度、dNTP用量及Taq酶進行了考察。結果顯示,該位點特異PCR循環(huán)數在23~35,正品肉蓯蓉出現了穩(wěn)定,清晰的鑒別條帶,而當循環(huán)數小于20個時,鑒別條帶開始變暗,甚至不出現鑒別條帶;退火溫度在50~63℃,均可出現穩(wěn)定的鑒別條帶,可見,退火溫度對于本研究的位點特異PCR影響不大;在對Taq酶的考察中,發(fā)現加入ExTaq酶的結果明顯優(yōu)于加入rxTaq酶的結果,所以建議使用該引物鑒別時最好使用ExTaq酶;另外,引物用量CD_1F/CD_2R在2.5/2.5~10.0/10.0pmol,dNTP用量在10~20pmol都能擴增出鑒別條帶,引物用量和dNTP用量均不宜太高,這與以前學者報道的相符。綜上,通過擴增條件的考察,并結合實際的應用情況。最終確定出最優(yōu)的鑒別PCR反應體系:2.5μL10×ExTaqbuffer緩沖液,2μL(10mmol·L-1)dNTPS,引物各0.25μL(10pmol·L-1),ExTaq酶0.2μL(5U·μL-1),DNA1μL,滅菌蒸餾水19.8μL。而PCR反應條件中,循環(huán)數優(yōu)化為25個,這樣縮短了鑒別時間,退火溫度對于本研究的影響不大,建議為50℃為宜。3.4不同方法提取np-pcr法本研究對荒漠肉蓯蓉,鎖陽和黃花列當的鑒別分別采用了DNA序列分析法和位點特異性PCR法。實驗結果表明,使用DNA序列分析法,在構建的系統(tǒng)發(fā)育樹上,正品和混偽品明顯分在了不同枝上,且支持率高達99%,可見此法能夠鑒別開真?zhèn)?使用位點特異性PCR法,同一反應條件下,鑒別引物能夠把正品荒漠肉蓯蓉擴增出331bp的條帶,而混偽品鎖陽和黃花列當無此條帶,可見此法同樣能夠鑒別開真?zhèn)?。雖然2種方法都能把正品荒漠肉蓯蓉與混偽品鎖陽和黃花列當鑒別開,但是與位點特異性PCR法相比,存在周期長,實驗繁瑣,實驗成本高以及不利于實際推廣等缺點。而采用位點特異性PCR方法鑒別肉蓯蓉所用鑒別時間較短,實驗操作簡單,無需測序,成本也較低,并有利于實際推廣。所以位點特異性PCR方法的建立為中藥材肉蓯蓉的快速鑒別技術提供了新方法、新思路。4肉霜的pcr檢測肉蓯蓉作為一味傳統(tǒng)名貴藥材,不論是在傳統(tǒng)中藥還是在民族藥蒙藥中,都具有廣泛而悠久的應用歷史,但是由于其產量有限,藥用價值和商業(yè)價值較高,所以經常在市面上出現肉蓯蓉混偽品,而其中鎖陽和黃花列當就是眾多混偽品的2種。本研究基于原植物的核基因ITS序列,篩選獲得了用于鑒別肉蓯蓉,鎖陽和黃花列當的位點特異引物,并建立了位點特異PCR方法,通過對反應條件的優(yōu)化,利用該方法得到了穩(wěn)定,清晰的鑒別條帶,可以正確鑒別出肉蓯蓉及混偽品鎖陽和黃花列當。該方法的建立有別于DNA序列分析法,本研究建立的位點特異PCR鑒別方法,操作簡便,鑒定速度快,對于鑒別人員的專業(yè)要求也不是很高,具有較高的應用價值。同時,該方法的建立為將來開發(fā)肉蓯蓉快速鑒別試劑盒提供了一定技術支持。但是,本研究也存在一定的局限性,就是肉蓯蓉的混偽品不止是鎖陽和黃花列當,還存在其他混偽品,比如同屬的鹽生肉蓯蓉,沙蓯蓉等,由于野生樣品采集的困難,所以對于肉蓯蓉與其他混偽品的鑒別,還有待進一步研究。2×CTAB提取液,1×TAE緩沖液,瓊脂糖(Promega公司),溴化乙錠(Fluka公司),DNATaq聚合酶(Takara公司),2000bpDNAMarkar(Takara公司),三氯甲烷﹑無水乙醇﹑異丙醇均為國產分析純。PCR儀(德國Eppendorf,型號5332),電泳系統(tǒng)(北京市六一儀器廠,型號DYY-12),低溫