海洋細菌hy-1的分離鑒定及抗金黃色葡萄球菌的分子鑒定

海洋細菌hy-1的分離鑒定及抗金黃色葡萄球菌的分子鑒定

材料和方法1材料表面1.1海泥樣品采集自煙臺第一個海濱浴場附近。1.2標準菌株標準株金黃葡萄球菌和大腸埃希菌為本實驗室保存菌種;MRSA為軍事醫(yī)學科學院贈予。1.3細菌基因組dna提取rTaq聚合酶、dNTP、pMD-18T載體、DH5α感受態(tài)細胞均購自大連寶生物制品有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物技術(shù)有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。1.4pcrDYY-ZC型電泳儀,購于北京市六一儀器廠;自動CCD凝膠成像系統(tǒng),購于天能科技有限公司;隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱,購于上海躍進醫(yī)療器械廠;BS-2F振蕩培養(yǎng)箱,購于國華電器有限公司;9600型PCR擴增儀,為美國PekinElmer公司產(chǎn)品;超凈工作臺(SW-CJ-1F型),購于濟南綠之潔科技有限公司;紫外可見分光光度計,購于北京普析通用儀器有限責任公司。1.5響應(yīng)面樹高氏一號固體培養(yǎng)基,含2.0%可溶性淀粉、0.1%KNO3、0.05%NaCl、0.05%KH2PO4、0.05%MgSO4·7H2O、0.001%FeSO4、1.5%瓊脂,pH7.2～7.4。LB培養(yǎng)基:含1%蛋白胨,0.5%酵母膏,1%NaCl,固體培養(yǎng)基加1.5%瓊脂,121℃滅菌20min。2方法2.1混懸液的稀釋和濃度的配制取采自不同地點的海泥樣品各1g,加無菌水10ml,充分振蕩混勻,使成10倍稀釋的混懸液(0.1g/ml)。取上述樣品混懸液1ml,用9ml無菌水稀釋,使成100倍稀釋的混懸液(0.01g/ml)。上述兩種混懸液各吸取200μl,分別均勻涂布于高氏一號培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)3～9d。培養(yǎng)過程中每天觀察細菌生長情況,待菌落形成后適時挑取形態(tài)不同的單菌落,劃線接種于新的平板培養(yǎng)基上,繼續(xù)在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),并從中再次挑取單菌落劃線培養(yǎng),直至分離得到純菌株,命名HY-1。2.2實驗培養(yǎng)基的革蘭顯微觀察對分離純化得到的菌株先后接種高氏一號和LB固體培養(yǎng)基,分別于28℃培養(yǎng)3～7d和37℃培養(yǎng)1～2d,革蘭染色后光學顯微鏡下觀察。2.3受試菌的篩選將純化得到的菌株進行抗菌譜的測定。抑菌試驗采用紙片擴散法,分別采用劃線接種法和混合倒平板法,受試菌分別為金黃葡萄球菌、大腸埃希菌和MRSA。37℃培養(yǎng)1～2d觀察結(jié)果。2.41srdna分析將細菌HY-1接種在平板上,37℃培養(yǎng)過夜。取單一菌落接種于4mlLB培養(yǎng)基中,采用索萊寶公司試劑盒提取細菌基因組。PCR擴增的正向引物16SrDNAF:5′-CGGCGTGCCTAATACATGCAAG-3′;反向引物16SrDNAR:5′-GGCATGCTGATCCGCGATTACTA-3′(引物由上海博尚生物技術(shù)公司合成)。50μlPCR反應(yīng)體系:模板1μl,2×mix25μl,16srDNAF3μl,16SrDNAR3μl。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性6min;94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸80s,共30個循環(huán);最后72℃溫育10min。PCR擴增產(chǎn)物用GelExtractionKit試劑盒DNA純化系統(tǒng)回收,交由上海美吉工程技術(shù)公司進行序列測定。測序后的16SrDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對。選取同源性較高(>97%)的16SrDNA基因序列作為參比對象,構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。使用ClustalX1.83軟件進行多序列比對,然后采用鄰位相接法(Neighbour-joining)和利用MEGA3.1軟件繪制系統(tǒng)進化樹。結(jié)果1培養(yǎng)基的生長在分離培養(yǎng)過程中,HY-1菌株對其他菌株有抑制作用(圖1)。純培養(yǎng)菌能分解淀粉,菌落周圍有明顯的溶淀粉圈。在高氏一號培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)7d,菌落生長緩慢,稀疏,較小,白色半透明,表面光滑,邊緣不整齊,似雪花狀;在LB固體培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)2d,菌落生長快速,鋪滿整個平板,表面光滑,有突起,粘稠,乳黃色,邊緣不整齊,直徑約為1～2mm。該菌革蘭染色陽性,桿狀,產(chǎn)芽胞,芽胞位于中央或偏向一側(cè),小于菌體,似炭疽桿菌。2抑菌活性活性采用紙片法測定HY-1菌株對金黃葡萄球菌、大腸埃希菌、MRSA的抑菌活性。其中對金黃葡萄球菌有較強的抑制作用(圖2),對大腸埃希菌和MRSA的抑制作用較弱。316細菌基因組檢測挑取純培養(yǎng)的單一菌落HY-1培養(yǎng)過夜,提取細菌基因組,以特定引物進行PCR擴增并回收、純化16SrDNA,1%瓊脂糖電泳檢測其大小為1254bp(圖3)。416srdna分析HY-1菌株的16SrDNA序列提交GenBank核苷酸序列數(shù)據(jù)庫,GenBank號為JN851704。為進一步確定該海洋細菌的分類地位,將測序結(jié)果進行BLAST,選取相關(guān)的14個細菌的16SrDNA的序列結(jié)果進行系統(tǒng)關(guān)系分析,用MEGA3.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)樹(圖4)。經(jīng)過同源性分析,HY-1與蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌聚成一枝,同源性達100%,與枯草芽胞桿菌和短小芽胞桿菌的相似度為98%。綜合HY-1的形態(tài)、生理生化特征和16SrDNA的序列結(jié)果,將HY-1鑒定為蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)。關(guān)于海洋細菌的活性成分自從1966年第一株有抑菌作用的海洋細菌被發(fā)現(xiàn)以來,越來越多的具有抑菌活性的細菌被分離出來。目前已報道的這類海洋細菌主要有假單胞菌(Pseudomonas),交替單胞菌(Alteromonas),弧菌屬(Vibrio),螺菌屬(Spirillum),玫瑰桿菌(Roseobacter),光合細菌(Photosynbacter),藤黃微球菌(Micrococcusleteus),煙草節(jié)桿菌(Arthrobacternicotiana)等。徐長安等篩選到1株海洋芽胞桿菌對鰻弧菌有較強的致病作用,并應(yīng)用于海水養(yǎng)殖中。李淑彬等從大亞灣海底沉積物中分離到1株具有廣譜抗真菌活性的曲霉,該菌對多種酵母菌、皮膚感染菌均具有強烈的抑制活性。呂家森從海洋微生物中分離到多株對腫瘤細胞的生長具有抑制作用的海洋細菌。本研究從海泥篩選到1株對金黃葡萄球菌有較強抑制活性的海洋細菌HY-1。該菌在高氏一號培養(yǎng)基上生長緩慢,菌落小,雪花狀,而在LB固體培養(yǎng)基上生長快速,菌落較大。常規(guī)細菌學方法檢測該細菌為革蘭染色陽性桿菌,產(chǎn)芽胞,能溶解淀粉,具有芽胞桿菌屬的特征。該菌對金黃葡萄球菌有較強的抑制作用,而對大腸埃希菌和MRSA作用甚微。從系統(tǒng)發(fā)育樹上看,該細菌與芽胞桿菌屬的蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌同源性最高。與其他芽胞桿菌如枯草芽胞桿菌相似性也較高,而與居藻芽胞桿菌(Bacillusalgicola)相似度較所列出的其他芽胞桿菌相似度低。本研究從形態(tài)、生理生化、系統(tǒng)發(fā)育學、16SrDNA序列同源性等方面分析,將菌株HY-1鑒定為蠟樣芽胞桿菌,并證明該菌對致病性金黃葡萄球菌具有較強的抑菌活性,為深入研究其抗菌譜及篩選產(chǎn)生抗生素的新型海洋微生物奠定了基礎(chǔ)。海洋微生物次生代謝產(chǎn)物是新穎結(jié)構(gòu)和活性天然產(chǎn)物的重要來源,也是抗菌藥物發(fā)現(xiàn)的重要源泉。作者分別從煙臺第一海水浴場近海海水、海泥以及煙臺大學近海海水中篩選具有抗菌活性的菌株,采用紙片擴散法測定樣品的抑菌活性,發(fā)現(xiàn)純化的來自于海泥樣品的細菌對金黃葡萄球菌具有較好的抑菌作用。本研究進一步對該菌株的形態(tài)、生理生化、16SrDNA序列同源性、系統(tǒng)發(fā)育學進行分析比較,以期確定其分類地位。***金黃葡萄球菌是一種危害嚴重的機