腸道內(nèi)添加益生菌對(duì)腹腔感染大鼠腸道微生態(tài)的影響

腸道內(nèi)添加益生菌對(duì)腹腔感染大鼠腸道微生態(tài)的影響

通常，腸道的微生態(tài)處于平衡狀態(tài)。在腹腔感染、休克、創(chuàng)傷等應(yīng)激狀態(tài)或大量使用抗生素,長(zhǎng)期禁食而使用靜脈營(yíng)養(yǎng)的情況下,可導(dǎo)致腸微生態(tài)的破壞,容易出現(xiàn)腸道菌群紊亂,進(jìn)而細(xì)菌易位增加,造成不良后果。而正常的腸道菌群作為一種生物屏障,對(duì)減少細(xì)菌易位可能有積極作用。為此,我們通過(guò)建立腹腔感染大鼠模型,觀察補(bǔ)充益生菌對(duì)腸道菌群及細(xì)菌易位的影響。腸外灌注益生菌實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性清潔級(jí)SD大鼠16只,體質(zhì)量250～320g,復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房提供,生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2002-0002,使用許可證號(hào):SYXK(滬)2002-0011,隨機(jī)分成2組,每組8只。對(duì)照組腹腔感染造模成功后,在造模當(dāng)天給予生理鹽水靜脈滴注維持,腹腔感染造模后1～5d給予靜脈營(yíng)養(yǎng)支持;實(shí)驗(yàn)組腹腔感染造模成功后,靜脈營(yíng)養(yǎng)加用益生菌的腸外營(yíng)養(yǎng)。兩組大鼠于造模成功后第6天處死取樣。腸內(nèi)灌注益生菌益生菌由上海交大昂立股份有限公司生產(chǎn)。其主要成分為嗜酸乳桿菌及其代謝產(chǎn)物,活菌約為108CFU/mL,經(jīng)空腸造瘺管每天分3次緩慢注入,約10mL/d。培養(yǎng)基和微生物培養(yǎng)方法1.含半胱氨酸的Ringer緩沖液:含有半胱氨酸0.25g的Ringer1片(Oxoid),蒸餾水500mL,121℃15min。2.雙歧桿菌培養(yǎng)基(EugonTomato培養(yǎng)基):番茄汁400mL(自制),Eugon瓊脂45.4g(BBL),麥芽糖10g,氯化血紅素(5mg/mL)1mL(Sigma),瓊脂5g(Difco),蒸餾水600mL,pH6.0,118℃15min。3.產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)基(N-N瓊脂培養(yǎng)基):BactoPetone40g(Difco),Na2HPO45g,Ka2HPO41g,NaCl2g,MgSO40.1g,葡萄糖2g,Bacto瓊脂25g(Difco),蒸餾水1000mL,pH7.6,115℃15min。冷卻至45℃,加蛋黃EggYolkEmulsion100mL(Oxoid)、硫酸新霉素(50mg/mL)4mL。4.乳酸桿菌培養(yǎng)基(MRS瓊脂培養(yǎng)基):MRSBroth55g(Difco),瓊脂15g(Difco),蒸餾水1000mL,121℃15min。冷卻至45℃,加入添加劑磷霉素(15.9mg/mL)、磺胺甲氧甲嘧啶(18.6mg/mL)、三甲氧卞氨嘧啶(1mg/mL)各5mL。5.麥康凱平板購(gòu)自伊華公司;厭氧盒和厭氧產(chǎn)氣袋購(gòu)自生物梅里埃公司;心腦浸出液購(gòu)自O(shè)xoid公司。腸道菌群厭氧培養(yǎng)取盲腸內(nèi)糞便0.1g置于9mL含半胱氨酸的Ringer稀釋液中,攪拌混勻,并制成濃度分別為10-2、10-4、10-6、10-8g/mL的4種混懸液。各取100μL混懸液分別在麥康凱培養(yǎng)基、EugonTomato培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基上均勻涂抹。(36±1)℃孵育24～48h后,觀察菌落形態(tài)并計(jì)數(shù)。細(xì)菌易位測(cè)定取大鼠腔靜脈血1mL、腸系膜淋巴組織、肝臟中葉和右肺下葉組織,在勻漿機(jī)中勻漿后分別置于心腦浸出液管中,35℃增菌。孵育18～24h后,分別接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上,35℃孵育18～24h后測(cè)定,易位率=陽(yáng)性個(gè)數(shù)/(大鼠個(gè)數(shù)×4)。細(xì)菌定量按照稀釋濃度的高低順序,挑取菌落生長(zhǎng)分散的平板,計(jì)數(shù)菌落數(shù),并乘以稀釋倍數(shù)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用SPSS10.0forwindows版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)采用x±sx±s表示,對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)及相關(guān)分析。結(jié)果細(xì)菌的鑒定1.形態(tài)、革蘭染色挑取EugonTomato培養(yǎng)基上的可疑菌落,在相差顯微鏡下活體觀察。形態(tài)為多形型,菌體呈直、彎、分叉、球拍狀或棒狀(X、V、Y型等),革蘭染色為陽(yáng)性桿菌。對(duì)可疑菌落采用DadeBehring公司的MicroscanAutoscan-4系統(tǒng)和RA-ID板進(jìn)一步鑒定(圖1)。2.愛(ài)酸乳菌挑取MRS瓊脂培養(yǎng)基上灰白、中等大小、可疑的菌落,在相差顯微鏡下活體觀察,菌體呈桿狀、短鏈狀、柵狀,革蘭染色為陽(yáng)性桿菌。3.產(chǎn)氣梭菌在N-N瓊脂培養(yǎng)基上,菌落周?chē)霈F(xiàn)乳白色渾濁圈,為卵磷脂酶分解卵磷脂所致。本菌為革蘭陽(yáng)性粗大桿菌,芽胞位于菌體中央或次極端。4.兩組的細(xì)菌易位率比較麥康凱平板上生長(zhǎng),菌落濕潤(rùn),中等大小,革蘭染色為陰性桿菌。細(xì)菌易位情況對(duì)照組大鼠遠(yuǎn)處及近處臟器的細(xì)菌易位率為59.3%,而實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌易位率為34.3%,較對(duì)照組明顯減少(P<0.05)。腸菌群中各菌種數(shù)量實(shí)驗(yàn)組大鼠腸道內(nèi)的正常菌群,除腸桿菌無(wú)差異外,雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌都較對(duì)照組的大鼠多,而腸道內(nèi)的有害菌產(chǎn)氣莢膜梭菌較對(duì)照組大鼠少,有明顯差異(P<0.05)(表1)。益生菌對(duì)腸道菌群的影響人體正常腸道菌群含有400～500種不同類(lèi)型的細(xì)菌,在這種情況下,宿主與細(xì)菌之間借助對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用,在消化道形成諸多相互作用的關(guān)系,維持著消化道的平衡。在某些病理情況下,隨著這種平衡被打破,腸道內(nèi)的細(xì)菌可出現(xiàn)在腸外組織,如大網(wǎng)膜、腸系膜淋巴結(jié)、門(mén)靜脈、肺等其他組織,這一過(guò)程稱為細(xì)菌易位。腸道是重癥感染病原菌的儲(chǔ)庫(kù),在正常情況下,各菌群經(jīng)常會(huì)有少量的細(xì)菌向周?chē)l(fā)生橫向或縱向轉(zhuǎn)移,但由于數(shù)量少,以及各菌庫(kù)原生境的原籍菌的生物拮抗作用和宿主的免疫機(jī)制,盡管會(huì)經(jīng)常發(fā)生,但不會(huì)轉(zhuǎn)移成功。在腹腔感染時(shí),因抗生素的大量使用及長(zhǎng)期禁食,可導(dǎo)致腸微生態(tài)破壞,機(jī)體免疫力降低,腸道動(dòng)力下降,條件致病菌過(guò)度繁殖,在腸黏膜上皮定植,細(xì)菌移位增加,腸屏障受到破壞,轉(zhuǎn)移菌數(shù)量過(guò)大,移位就成為可能。所以腸道內(nèi)維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),保護(hù)機(jī)體免受病原微生物入侵顯得尤為重要。目前認(rèn)為雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌是人體有益生理菌,因能與腸上皮細(xì)胞和諧共生,被視為人體腸道健康衛(wèi)士,其重要性已得到重視。本研究對(duì)腹腔感染大鼠模型分別實(shí)施腸外營(yíng)養(yǎng)和加用益生菌的腸外營(yíng)養(yǎng),觀察它們對(duì)腸道菌群改變、細(xì)菌易位的影響。在實(shí)驗(yàn)中我們可以看到,給予加用益生菌的腸外營(yíng)養(yǎng)后,大鼠死亡率以及血、腸系膜淋巴組織、肝和肺的細(xì)菌易位率都明顯低于對(duì)照組。糞便厭氧培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)組大鼠除腸桿菌沒(méi)有明顯增加外,乳酸桿菌和雙歧桿菌在數(shù)量上都明顯高于對(duì)照組(P<0.05);而潛在致病菌中產(chǎn)氣莢膜梭菌明顯減少(P<0.05)。對(duì)照組明顯引起了腸道菌群紊亂,致病菌增加;而加入益生菌后,增加了有益菌的含量,降低了致病菌的數(shù)量。提示益生菌能調(diào)節(jié)腸道菌群微生態(tài)平衡,保護(hù)腸屏障功能,減少腸道細(xì)菌易位。取樣的時(shí)間和方法對(duì)結(jié)果有重要影響。由于雙歧桿菌屬于專(zhuān)性厭氧菌,對(duì)氧的耐受性差,所以及時(shí)接種