sp級(jí)balbca-ne小鼠主要臟器重量和血液生理生化指標(biāo)的測定

sp級(jí)balbca-ne小鼠主要臟器重量和血液生理生化指標(biāo)的測定

balb-c-a-nu大鼠是由嘲弄人和編寫的系cbalb-cabon-nu和balb-cancly-nu組成的。1985年，crj從毫米根獲得了一個(gè)明確的balb-cancly-nu，并在同年接受了腹部生產(chǎn)。這種老鼠是一個(gè)接近雜交的系統(tǒng)。根據(jù)遺傳監(jiān)測，它是胸腺缺失的第11個(gè)染色體。由于無胸腺,僅有胸腺殘跡或異常上皮,不能使T細(xì)胞正常分化,故造成T細(xì)胞缺陷。B淋巴細(xì)胞正常,但功能缺陷,抗體主要為IgM,只有少量IgG,無接觸敏感性,無移植排斥反應(yīng)。BALB/cA-nu小鼠作為免疫缺陷動(dòng)物,目前已被廣泛應(yīng)用到腫瘤學(xué)、免疫學(xué)和藥品與生物制品的安全性方面的評(píng)價(jià)以及有效藥品的篩選等實(shí)驗(yàn)方面的研究。BALB/cA-nu小鼠自從國外引進(jìn)后已經(jīng)超過20代,隨著飼養(yǎng)環(huán)境、營養(yǎng)、繁殖育種以及管理等諸多方面的差異,對(duì)于此小鼠的遺傳、生理生化以及免疫功能等生物學(xué)特性是否發(fā)生改變,尚缺乏了解,還需進(jìn)一步驗(yàn)證和探討,故我們對(duì)本單位5、10周齡的BALB/cA-nu小鼠的主要臟器重量、血液生理生化指標(biāo)進(jìn)行了測定;同時(shí)為驗(yàn)證其免疫缺陷特性,我們采用流式細(xì)胞儀對(duì)6周齡的BALB/cA-nu小鼠的免疫細(xì)胞做了相關(guān)檢測,為我國利用該品系動(dòng)物從事生物醫(yī)藥研究的科研人員提供基礎(chǔ)生物學(xué)數(shù)據(jù)。1材料和方法1.1小鼠血生理生化指標(biāo)的測定取SPF級(jí)BALB/cA-nu小鼠5、10周齡各24只,雌、雄比例1∶1,共計(jì)48只,用于臟器重量和血生理生化指標(biāo)檢測;取6周齡的BALB/cA-nu小鼠4只,雌、雄比例1:1,用于免疫細(xì)胞測定。所有動(dòng)物均由北京華阜康生物科技股份有限公司提供,生產(chǎn)許可證號(hào)為:SCXK(京)2009-0004。該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所解剖實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為:SYXK(京)2013-0019。1.2動(dòng)物、飼養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)BALB/cA-nu小鼠均飼養(yǎng)在北京華阜康生物科技股份有限公司SPF車間的隔離器內(nèi),隔離器內(nèi)的潔凈度為5級(jí)標(biāo)準(zhǔn),溫度控制在23±3℃,相對(duì)濕度40%~70%,換氣次數(shù)每小時(shí)為20次,明暗照明周期為12h∶12h,動(dòng)物自由采食和飲水。小鼠的飼料為北京華阜康生物科技股份有限公司生產(chǎn)的60Co小鼠繁殖料1315(SCXK(京)2009-0008)。飼料的營養(yǎng)成分為:粗蛋白≥23.0%、粗脂肪≥5.0%、粗灰分≤7.0%、粗纖維≤5.0%、水份≤10%、鈣1.4%~1.5%、磷1.0%~1.1%、賴氨酸≥1.32%、蛋氨酸+胱氨酸≥0.78%水為酸化過濾自來水(ph=2.7~3.0)并經(jīng)121℃30min高壓蒸汽滅菌,使用的墊料等物品均經(jīng)過132℃30min高壓蒸汽滅菌,每周更換1次墊料,進(jìn)出隔離器的物品進(jìn)行嚴(yán)格消毒,嚴(yán)格遵守隔離系統(tǒng)操作規(guī)程。1.3儀器、試劑和儀器法國ABXPentraDX120血細(xì)胞分析儀和配套試劑、日立7100全自動(dòng)生化分析儀和配套試劑、美國貝克曼Allegra64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、美國BD公司流式細(xì)胞儀(FACS)、紅細(xì)胞裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)。1.4實(shí)驗(yàn)方法1.4.1測量重量和器官重量1.5單因素方差統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差統(tǒng)計(jì)分析,以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示,顯著水平為P<0.05。2結(jié)果2.1體重、肝臟和雙腎重量由表1可見,同周齡的BALB/cA-nu小鼠,雄鼠的體重、肝臟和雙腎重量高于雌鼠(P<0.05)。同性別的BALB/cA-nu小鼠,5周小鼠的肺臟、肝臟、雙腎重量明顯低于10周齡小鼠(P<0.05)。2.2hbc、mch、hct的值比較由表2可見,同周齡的BALB/cA-nu小鼠,雄鼠HGB、MCH和HCT的值高于雌鼠(P<0.05)。同性別的BALB/cA-nu小鼠,5周小鼠RDW的值高于10周齡小鼠(P<0.05)。2.3p>0.05表達(dá)對(duì)應(yīng)物的2.5由表3可見,同周齡的BALB/cA-nu小鼠,雄鼠TBIL的值高于雌鼠(P<0.05)。同性別的BALB/cA-nu小鼠,5周小鼠TP、GLOB、CHO、TBIL、UN的值明顯低于10周齡小鼠(P<0.05),而5周小鼠A/G的值高于10周齡小鼠(P<0.05)。2.4鼠外周血無t細(xì)胞,cd4+t細(xì)胞,cd19+b細(xì)胞的比例圖1顯示的是一只BALB/cA-nu小鼠外周血中T細(xì)胞及其亞群、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和粒細(xì)胞的百分比。由圖2可見,BALB/cA-nu小鼠外周血無T細(xì)胞(0.18±0.06)%、CD4+T細(xì)胞(0.26±0.08)%、CD8+T細(xì)胞(0.13±0.04)%,CD19+B細(xì)胞的比例為(30.10±2.74)%、B220+B細(xì)胞的比例為(30.55±2.77)%,NK細(xì)胞比例為(1.35±0.29)%,粒細(xì)胞比例為(47.90±5.48)%。3小鼠血生化指標(biāo)的變化截止目前,國內(nèi)報(bào)道有關(guān)BALB/cA-nu小鼠的主要臟器重量,血生理生化指標(biāo)以及免疫細(xì)胞等基本生物學(xué)特性的文獻(xiàn)并不多,而這些指標(biāo)又都是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的重要基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。臟器重量是鑒定動(dòng)物遺傳品質(zhì)的重要依據(jù),而血生理生化值又是生物醫(yī)藥研究的基礎(chǔ)指標(biāo),本研究通過對(duì)5、10周齡BALB/cA-nu小鼠的主要臟器重量、12項(xiàng)血生理、15項(xiàng)血生化指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果表明,同周齡的BALB/cA-nu小鼠的雌雄相比,體重、肝臟、雙腎重量差異具有顯著性,此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致,血生理指標(biāo)HGB、MCH差異有顯著性與張修彥的BALB/c小鼠的報(bào)道相一致;同性別小鼠的5周與10周相比,肺臟、肝臟、雙腎差異具有顯著性,TP、GLOB、A/G、CHO、TBIL、UN血生化指標(biāo)差異顯著。另外,本研究中測定BALB/cA-nu小鼠的主要臟器,血生理生化的數(shù)據(jù),通過與日本SLC公司的1998年的數(shù)據(jù)集中刊登的10周齡的BALB/cSlcnu/nu小鼠相比,脾臟、WBC、GLU、CREA、TBIL的值稍低,其余各項(xiàng)值很接近;與CharlesRiver公司2011年1月至2012年12月刊登的8~10周齡的BALB/cNude小鼠相比,血生理很接近,只有血生化中GLU、CREA、TBIL的值偏低。造成此類差異的因素,除品系、飼養(yǎng)環(huán)境、營養(yǎng)因素外,樣品的采集、貯存處理、儀器、試劑及人員操作等因素的影響也是至關(guān)重要的,尤其是GLU、TBIL分別對(duì)時(shí)間和光照的敏感性,據(jù)趙曉紅報(bào)道血液離體后,隨著度逐漸下降,大約每小時(shí)下降5%~7%;血液中的總膽紅素,絕大部分為非結(jié)合膽紅素,血樣在受到光照后,使膽紅素中相當(dāng)部分的非結(jié)合膽紅素形成構(gòu)型異構(gòu)體,繼而進(jìn)一步形成結(jié)構(gòu)異構(gòu)體,由于結(jié)構(gòu)異構(gòu)體不能參與重氮反應(yīng),導(dǎo)致測得TBIL比實(shí)際的值低,但TBIL值偏低,在臨床上無相對(duì)意義。另外,實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁食時(shí)間的差異,也對(duì)WBC、CREA、GLU等指標(biāo)有影響。BALB/cA-nu小鼠作為免疫缺陷動(dòng)物,因其T細(xì)胞特異性免疫缺陷,使其被廣泛地應(yīng)用到免疫學(xué)和藥物研發(fā)研究。機(jī)體的特異性免疫功能分為細(xì)胞免疫和體液免疫,細(xì)胞免疫過程主要是由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的,通過T淋巴細(xì)胞特異性地識(shí)別抗原,使T細(xì)胞活化、增殖和分化,發(fā)揮免疫效應(yīng)。T細(xì)胞抗原受體(TCR)和CD3+均為T細(xì)胞膜上的重要分化抗原,是成熟T細(xì)胞的特征性標(biāo)志,T細(xì)胞表面的TCRCD3+構(gòu)成復(fù)合體;CD4+和CD8+是T細(xì)胞表面的糖蛋白,CD4+主要表達(dá)MHCⅡ限制的T細(xì)胞,CD8+主要表達(dá)MHCⅠ限制的T細(xì)胞,CD4+和CD8+作為輔助分子增強(qiáng)T細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞(APC)或CTL靶細(xì)胞間的相互作用。CD4+和CD8+的功能與TCR的功能錯(cuò)綜復(fù)雜地聯(lián)系在一起,因此CD4+和CD8+分子通常被視為判斷和鑒定T細(xì)胞亞群及其成熟的標(biāo)志。B淋巴細(xì)胞是唯一能夠產(chǎn)生抗體的細(xì)胞,B220+是小鼠全B細(xì)胞最常用標(biāo)記,但這個(gè)標(biāo)記也表達(dá)于活化T細(xì)胞、活化NK細(xì)胞和NK祖細(xì)胞。相對(duì)來說,CD19+是B細(xì)胞較特異的標(biāo)記,主要表達(dá)大多數(shù)B細(xì)胞,從祖B細(xì)胞階段開始表達(dá)直至漿細(xì)胞階段。因此我們通過標(biāo)記6周齡BALB/cA-nu小鼠全血中的CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、B220+、NK1.1+、CD11b+抗體基檢測此小鼠體內(nèi)不同的免疫細(xì)胞情況,結(jié)果表明BALB/cA-nu小鼠表現(xiàn)為T細(xì)胞免疫缺陷。實(shí)驗(yàn)前禁食12h,禁水1h,用電子天平稱取5、10周齡小鼠體重,眼眶采血后脫頸椎處死,立即剖取脾臟、肝臟、腎臟、心臟、肺臟、腦,并用濾紙吸干組織表面的水分,稱取重量。1.4.2紅細(xì)胞計(jì)數(shù)hbc從小鼠眼眶后靜脈叢采血,取0.2mL血液到EDTA2k抗凝管內(nèi),進(jìn)行血生理測定。12項(xiàng)血生理指標(biāo)為:血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞(RBC)計(jì)數(shù)、白細(xì)胞(WBC)計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞(LYM)、血小板(PLT)、平均血小板體積(MPV)、血小板壓積(PCT)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白(MCH)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細(xì)胞體積分布寬度(RDW)。1.4.3生化指標(biāo)及血清將剩余的全血取0.8mL到離心管內(nèi),3000r/min,離心10min后取血清,進(jìn)行血生化測定。15項(xiàng)血清生化指標(biāo)為:總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、白蛋白/球蛋白(A/G)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、血糖(GLU)、總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、總膽紅素(TBIL)、尿素氮(UN)、肌酐(CREA)、無機(jī)璘(P)、血鈣(Ca)。1.4.4檢測內(nèi)容和方法采用小鼠摘眼球取血法取300μL外周血,經(jīng)紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞后,將細(xì)胞用1%BSA/PBS洗兩次