辣椒抗病基因同源序列的構(gòu)建

辣椒抗病基因同源序列的構(gòu)建

0nbs-lrr類抗病基因【研究意義】青椒是世界上廣泛種植的園藝作物，但由于各種疾病的影響，每年都會造成巨大的青椒產(chǎn)量損失。隨著分子生物學(xué)的深入研究，分離克隆辣椒抗病基因?qū)α私獠『Φ陌l(fā)生機(jī)制、植物抗病分子機(jī)理有著非常重要的作用，可為有效控制病害的發(fā)生和抗性育種打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。【前人研究進(jìn)展】當(dāng)前克隆到的大量植物抗病基因，根據(jù)其序列特征可分為5類，其中編碼含有核苷酸結(jié)合區(qū)和富含亮氨酸重復(fù)區(qū)（nucleotide-bindingsites-leucine-richrepeat,NBS-LRR）結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)抗病基因是其中最大的一類，約占總數(shù)的75%。NBS-LRR類抗病基因廣泛存在于植物中，如擬南芥中大約含有150個(gè)，水稻基因組中含有600多個(gè)，這些基因通常在染色體上成簇出現(xiàn)。NBS區(qū)被認(rèn)為是許多蛋白質(zhì)執(zhí)行功能的必需元件，與ATP和GTP的結(jié)合有關(guān)，而且它還具有激酶活性，可以激活其它功能蛋白。LRR結(jié)構(gòu)域則可能在蛋白質(zhì)的相互作用中起重要作用，參與抗病反應(yīng)的識別及識別后的抗病信號傳導(dǎo)。NBS-LRR類抗病基因含有一些高度保守的結(jié)構(gòu)域，如kinase-1a區(qū)（即P-loop區(qū)）、kinase-2區(qū)、kinase-3a、GLPL區(qū)等。根據(jù)這些保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)特異性的簡并引物，以植物基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，就可得到抗病基因的同源序列（RGA）。人們已利用這種方法在多種植物上克隆及定位了許多RGA。黃代軍等從柚的cDNA中獲得10個(gè)抗病基因同源序列，與已知抗病基因的氨基酸序列的同源性為11.5%～47.1%；Soriano等從杏樹中擴(kuò)增出6類RGA，并開發(fā)了27個(gè)AFLP-RGA的分子標(biāo)記，其中16個(gè)標(biāo)記用于構(gòu)建杏樹的遺傳圖譜；王海燕等根據(jù)NBS-LRR保守區(qū)設(shè)計(jì)兩對引物，采用RT-PCR方法從小麥中得到3個(gè)抗病基因同源片段，Northern雜交分析表明，它們在小麥葉片中為低豐度組成型表達(dá)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】經(jīng)典的植物抗病基因的克隆方法大多采用圖位克隆和轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法，如已克隆的擬南芥的RPS2基因，煙草的N基因等。自1995年人們發(fā)現(xiàn)已克隆的抗病基因存在一些相似的結(jié)構(gòu)后，就開展了使用這些保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)簡并引物分離和克隆抗病基因及其同源片段的研究。但用此方法擴(kuò)增辣椒RGA的報(bào)道還比較少見?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本文根據(jù)已知抗病基因的保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)簡并引物，在辣椒品系PR205的基因組DNA中分離抗病基因同源片段，并分析這些序列的同源關(guān)系，為辣椒抗病基因的分離和鑒定奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料表面供試材料為抗根結(jié)線蟲、蚜蟲的辣椒品系PR205，本實(shí)驗(yàn)室保存。1.2方法1.2.1基因i2c-1及擬南瞳霉病基因的構(gòu)建根據(jù)番茄抗根結(jié)線蟲基因Mi-1.2、細(xì)菌性斑點(diǎn)病prf、抗孢囊線蟲基因Hero、抗萎蔫病基因I2C-1及擬南芥抗霜霉病基因RPM1的NBS-LRR保守區(qū)域kinase-1a區(qū)（GVGKTT）和GLPL區(qū)（GLPLAL）的核酸序列特征，運(yùn)用Primer5軟件設(shè)計(jì)一對簡并引物，即由上海生工生物工程有限公司合成。1.2.2dna提取采集辣椒PR205的新鮮嫩葉，參照Fulton等的CTAB小量法提取基因組DNA。1.2.4ra圖2PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠檢測，利用凝膠回收試劑盒（上海生工）回收目的片段，克隆至pMD18-T載體（TaKaRa）中。16℃連接3h,4℃保存過夜。取5μl連接產(chǎn)物熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布于含有Amp/IPTG/X-gal的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜，挑選白斑若干，于含Amp50mg·L-1的液體LB培養(yǎng)基，37℃200r/min振蕩培養(yǎng)過夜，利用M13通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以確認(rèn)T載體中插入片段的有無及長度大小。1.2.5功能域分析序列分析首先使用NCBI的VecScreen程序去除測序片段中的載體序列，再使用BLAST搜索同源序列，然后結(jié)合NCBI的ORFfinder程序搜索開放閱讀框，并用pfam(http：///）進(jìn)行功能域分析。進(jìn)一步用ClustalX(1.81）軟件對候選基因片段進(jìn)行多序列比對，并構(gòu)建系統(tǒng)聚類圖。2結(jié)果與分析2.1對白蛋白重組子的檢測利用簡并引物DP1和DP2，以辣椒PR205基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增，獲得1條500bp左右的片段（圖1），這與所用引物預(yù)期的擴(kuò)增片段大小一致。目的片段經(jīng)回收、克隆，得到大量白斑重組子。隨機(jī)挑選其中的50個(gè)白斑重組子，搖菌，進(jìn)行PCR檢測，鑒定插入T載體中的片段及其長度。結(jié)果獲得了44個(gè)陽性重組子（部分結(jié)果見圖2），并按順序從1～44號進(jìn)行編號。2.2抗煙草花葉病基因的聚類分析隨機(jī)挑選其中35個(gè)陽性克隆進(jìn)行測序。結(jié)果表明，有25條序列具有完整開放讀碼框和NBS-LRR功能域，初步確認(rèn)這25條序列為RGAs。其它測序序列或含有多個(gè)終止子，或只存在兩條引物序列中的一條，或與RGAs序列特征相差太遠(yuǎn)，故下面的分析中將不再予以涉及。通過BLAST比對發(fā)現(xiàn)，這些序列與已知的抗病基因都有一定的關(guān)聯(lián)，如Mi、Hero、prf、I2C-1等。利用ClustalX(1.81）軟件對這25條具有連續(xù)ORF的氨基酸序列與已知抗病基因Mi-1.2、prf、Hero、I2C-1、RPM1、M（亞麻抗葉銹病基因）、N（煙草抗煙草花葉病毒基因）的相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行聚類分析。根據(jù)序列的相似性及聚類分析結(jié)果（圖3）將這些氨基酸序列分為兩大類：Ⅰ和Ⅱ。在第Ⅰ類中，只有基因M和N聚在一起，它們都屬于TIR-NBS-LRR類抗病基因；其余已知抗病基因及所有RGA均聚在第Ⅱ類中，它們則屬于non-TIR-NBS-LRR類抗病基因，而這些RGA又可以分為7個(gè)亞類（RGAⅠ～RGAⅦ），其中p12,p33,p1,p8,p11,p4,p35,p22,p6,p20,p32,p18和Mi-1.2聚為一類（RGAI）;p28,p21,p26,p9聚為一類(RGAII)；p23,p15,p29,p2和Hero聚為一類（RGAⅢ），25條辣椒RGA大部分都聚在這3類中。而且，亞類RGAⅡ、RGAⅣ、RGAⅤ和RGAⅦ沒有所選的已知抗病基因與其聚在一起，可能與用于聚類的抗病基因較少有關(guān)，也可能因?yàn)樗鼈儗儆谛碌目共』蝾愋?。由圖3還可看出，p20與Mi-1.2,p30和prf的遺傳距離非常小，說明p20和p30可能分別為Mi-1.2、prf基因的一部分或這兩個(gè)基因的同源片段。2.3各基因相似性分析根據(jù)進(jìn)化樹分析結(jié)果和核苷酸多態(tài)性，在辣椒7個(gè)RGA的亞類中，各選取一個(gè)居中的克?。╬35,p21,p29,p19,p10,p30,p25）作為代表進(jìn)行氨基酸序列相似性比較分析。利用DNAMAN軟件的多序列比對分析得到表1。這7類RGA之間及與已知抗病基因相應(yīng)區(qū)域的氨基酸序列的相似性為27.4%（RGAⅥ和RPM1）到98.2%（RGAⅥ和prf）。這7類RGA與Mi-1.2相應(yīng)區(qū)域氨基酸相似性為40.4%～90.4%；與I2C-1相應(yīng)區(qū)域氨基酸相似性為31.3%～40.6%；與prf相應(yīng)區(qū)域氨基酸相似性為32.7%～98.2%；與RPM1相應(yīng)區(qū)域氨基酸相似性為27.4%～33.5%；與Hero相應(yīng)區(qū)域氨基酸相似性為31.1%～94.6%。2.4關(guān)于實(shí)驗(yàn)型辣椒抗根結(jié)線蟲基因的同源性如圖4所示，p20與Mi-1.2核苷酸比較發(fā)現(xiàn)，只有在p20的第284位和第413位兩處的核苷酸與Mi-1.2不同，這可能是由于PCR擴(kuò)增時(shí)發(fā)生錯(cuò)配或是測序誤差所致。經(jīng)氨基酸比對發(fā)現(xiàn)兩者的同源性達(dá)99%，這說明在辣椒PR205中含有與番茄抗根結(jié)線蟲基因Mi-1.2同源性很高的基因，p20可能就是辣椒抗根結(jié)線蟲基因的一部分，這為辣椒抗根結(jié)線蟲基因的克隆提供了序列依據(jù)和理論支持。同樣，p30與prf進(jìn)行序列比對發(fā)現(xiàn)其核苷酸同源性為98%，氨基酸的同源性為99%，說明在該辣椒品種中也含有與prf同源的基因或p30就為prf抗病基因的一部分。3rga的擴(kuò)增、序列及序列分析在各種植物中，NBS結(jié)構(gòu)域都是高度保守的，這為利用同源序列法分離和克隆抗病基因同源片段提供了一條方便、快捷、簡單的途徑。使用簡并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增RGA的策略已在多種植物中取得成功。如大豆、甜菜、棉花、高粱和玉米等。擴(kuò)增這些RGA的主要目的是分離植物抗病基因或作為分子標(biāo)記輔助抗病育種。RGA與R基因主要有以下幾種關(guān)系：（1)RGA是R基因的一部分。Bendahmane等以馬鈴薯為材料，發(fā)現(xiàn)其中一類RGA與抗X病毒基因Rx2緊密連鎖，并被證明為該基因的一部分。（2)RGA與R基因緊密連鎖。Donald等根據(jù)RGA序列開發(fā)的一個(gè)650bp的CAPS(cleavedamplifiedpolymorphicsequence）標(biāo)記和一個(gè)850bp的SCAR(sequencecharacterizedamplifiedregion）標(biāo)記。此SCAR標(biāo)記與葡萄的灰霉病抗性位點(diǎn)共分離。（3)RGA與R基因無關(guān)。有些RGA與已知的R基因未能表現(xiàn)連鎖或相關(guān)關(guān)系，這類RGA可能并非是真正的抗病基因，也可能是未發(fā)現(xiàn)的新的抗病基因。本文也用此方法在辣椒PR205中成功地分離到25個(gè)抗病基因同源片段，而且這些RGA的序列都與已知的抗病基因或其它物種的RGA有密切關(guān)系。因此，它們中的某些RGA很有可能編碼一些未知抗病基因的產(chǎn)物。本試驗(yàn)中獲得的25個(gè)辣椒RGA的氨基酸序列之間表現(xiàn)了廣泛的相似性，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析將其分為7個(gè)不同的類別。除RGAⅠ、RGAⅡ、RGAⅢ外，其余類別只含有1個(gè)或2個(gè)成員，這說明在辣椒基因組中RGA的豐富度存在一定的差異性。在圖3中明顯看出p30與prf基因、p20與Mi基因的遺傳距離非常小。經(jīng)序列比對分析，p30與prf基因的核苷酸相似性達(dá)98%、氨基酸的相似性達(dá)99%，推斷p30可能是prf基因的一部分或同屬于一個(gè)基因家族；p20與Mi-1.2基因的核苷酸、氨基酸的相似性都達(dá)到了99%，推斷p20為Mi基因的一部分。根據(jù)p20的序列信息，陳儒鋼等利用RACE技術(shù)在辣椒PR205中克隆出高抗南方根結(jié)線蟲的基因CaMi(GenBank登陸號：DQ465825）。該基因全長5351bp，含有2個(gè)內(nèi)含子，大小分別為1297bp和72bp,mRNA長3986bp，其中5′非編碼區(qū)為86bp,3′非編碼區(qū)為126bp,CDS長3774bp，編碼1257個(gè)氨基酸。根據(jù)NBS-LRR抗病基因蛋白質(zhì)的N端是否含有果蠅Toll蛋白及哺乳動物白細(xì)胞介素-1受體（tollandinterleukin-1receptor,TIR）可將其劃分為兩個(gè)亞類：TIR類和non-TIR類。TIR和non-TIR類蛋白在NBS區(qū)存在明顯的差異：RNBS-A-TIR(LQKKLLSKLL）和RNBS-D-TIR(FLHIACFF）只特異地存在于TIR類抗病基因中，而RNBS-A-nonTIR(FDLxAWVCVSQxF）和RNBS-D-nonTIR(CFLYCALFPED）則專一地存在于non-TIR中。此外，NBSKinase-2區(qū)的最后一個(gè)氨基酸也可以用來區(qū)分這兩類抗病基因：當(dāng)此位點(diǎn)的氨基酸是色氨酸（W）時(shí)即歸為non-TIR類；是天門冬氨酸（D）時(shí)則歸為TIR類抗病基因，其準(zhǔn)確度可達(dá)95%。筆者的研究結(jié)果顯示，用于聚類的所有序列明顯地分為兩類：TIR類和non-TIR類。其中這25條辣椒RGA的編碼產(chǎn)物均為non-TIR類抗病相關(guān)蛋白，這可能與筆者用于設(shè)計(jì)引物的抗病基因序列信息均屬于這一類型有關(guān)，也可能是由于辣椒中的non-TIR類型的RGA含量比較豐富。4基于同源基因文庫建立了新的合成系統(tǒng)基因分子身份證mif-pcr檢測根據(jù)已知植物抗病基因的保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)簡并引物DP1、DP2，在辣椒品系PR205中擴(kuò)增得到25個(gè)RGA。經(jīng)過聚類分析及同源性比較，發(fā)現(xiàn)這25條RGA與已知的植物抗病基因都有一定的關(guān)系，并確認(rèn)p20是辣椒抗根結(jié)線蟲基因的一部分，即辣椒中也含有與Mi基因同源的根結(jié)線蟲抗性基因。這些研究結(jié)果為辣椒抗病基因的分離和克隆提供了條件，同時(shí)也說明利用同源序列法克隆辣椒