rh缺失型d-個體發(fā)生的分子機(jī)制

rh缺失型d--個體發(fā)生的分子機(jī)制

rh血漿原是一種氨基酸原體，通過對1號染色體橫截面1p34、3-1p36的編碼編碼了rwd和rece，rwd基因編碼了rwd基因，rece基因編碼了r2c、c和rhe。由于這2個基因高度同源,緊密連鎖,串聯(lián)排列,因此它們之間容易發(fā)生交換重組、缺失和點突變,從而產(chǎn)生多種變異體。Rh缺失型D--就是其中的一種變異體,其紅細(xì)胞的Rh抗原特點是D抗原表達(dá)增強(qiáng),無RhC/c和RhE/e抗原。這種血型雖極為罕見,但臨床意義非常重要。我們于2005—2006年發(fā)現(xiàn)了2例重度胎兒和新生兒溶血病,經(jīng)血清學(xué)檢測證實2名產(chǎn)婦均為Rh缺失型D--個體,分別來自近親和非近親婚配的家系,其溶血病是由于Rh缺失型D--母兒血型不合所致。為了進(jìn)一步明確兩個體的基因結(jié)構(gòu)和發(fā)生機(jī)制,我們對這兩例Rh缺失型D--個體及其家系成員采用PCR-SSP方法進(jìn)行基因分型,并根據(jù)PCR-SSP結(jié)果,對所有與血清學(xué)表型不符合的異常擴(kuò)增片段進(jìn)行克隆測序,現(xiàn)報告如下。1材料和方法1.1重度新生兒和新生兒血清學(xué)表型兩例Rh缺失型D--個體為我們于2005—2006年發(fā)現(xiàn)的2例重度胎兒和新生兒溶血病患者,其家系圖譜分別見圖1、2,血清學(xué)表型為DCcEe的陽性對照來自岳陽血站無償獻(xiàn)血者。1.2血液dna提取抽取兩家系成員外周EDTA抗凝血3ml,使用WatsonBiotechnologies血液DNA小提試劑盒,嚴(yán)格按照試劑盒說明提取DNA。1.3pcr擴(kuò)增及電泳采用G&TBiotech公司的Rh分型試劑盒,分別對RHD基因第10外顯子、內(nèi)含子,RHCE基因第2外顯子、內(nèi)含子,第5外顯子、內(nèi)含子進(jìn)行PCR擴(kuò)增?？偡磻?yīng)體系為9μl,包括引物混合物7μl,稀釋Taq酶1μl(約含0.33U),DNA樣本1μl(約含0.1—0.3μgDNA)。反應(yīng)條件為95℃30s,60℃30s,72℃90s,30個循環(huán)后置72℃再延伸5min,降溫至4℃。取7μlPCR產(chǎn)物直接點樣到2%凝膠孔中。以10V/cm電泳20min,然后在紫外光下拍照記錄。Rh基因擴(kuò)增產(chǎn)物長度見表1。1.4t4-dna連接酶系統(tǒng)回收純化的PCR產(chǎn)物后,采用PMD18-T載體與目的片段連接,總反應(yīng)體積為10μl,其中包括純化的PCR產(chǎn)物5μl,T4-DNA連接酶1μl,10×Buffer1μl,T載體1μl,雙蒸水2μl?？偡磻?yīng)體系置16℃水浴箱中,過夜連接后,轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)大腸桿菌,37℃恒溫培養(yǎng)16—20h。從LB培養(yǎng)基上挑選陽性菌篩選鑒定陽性克隆。提取質(zhì)粒DNA,然后采用M13-47引物在ABIPRISMTMDNA測序儀上進(jìn)行測序。2結(jié)果2.1pcr檢測d、e、e片段的表達(dá)血清學(xué)表型為DCcEe的正常個體PCR基因分型見圖3。PCR結(jié)果顯示D、C、c、E、e基因均有與之相對應(yīng)的擴(kuò)增條帶。家系1中的RhD--先證者1可以擴(kuò)增得到D、e基因相關(guān)片段(圖4),而C、c、E均未擴(kuò)增出來。其余的家系成員擴(kuò)增后均可以得到C、D、e片段,即PCR結(jié)果與血清學(xué)表型相符。家系2中RhD--先證者2同樣僅能擴(kuò)增出D、e基因相關(guān)片段(圖5),同時,我們也觀察到先證者父親與姨媽血清學(xué)表型為D+C-c+E+e-,擴(kuò)增后得到D、c、E、e片段(圖6、7)。其他家系成員PCR擴(kuò)增結(jié)果與血清學(xué)表型全部相符。2.2e片段核苷酸測定鑒于先證者1和先證者2血清型中無e抗原,而PCR分型中都能擴(kuò)增出e抗原相關(guān)基因,我們進(jìn)一步對它進(jìn)行了測序,結(jié)果發(fā)現(xiàn),先證者1的e片段存在3個核苷酸的改變:22位缺失C,48位由T突變成C,90位由A突變成G;先證者2測序后發(fā)現(xiàn)89位由T突變成C,見圖8。先證者2的姨媽與父親的e片段測序后經(jīng)比對分析未發(fā)現(xiàn)單核苷酸的突變。3ccee基因缺失RhD--缺失型是Rh血型系統(tǒng)一種極為罕見的變異體。RhD--缺失型個體極易由輸血或妊娠免疫,產(chǎn)生高效價針對CcEe位點的特殊抗體。這種抗體可引起不同程度的胎兒或新生兒溶血病,重者發(fā)病迅速,病情危重,核黃疸發(fā)生率及死亡率極高。由于RhD--血源非常稀有,一旦RhD--缺失型個體需緊急輸血,我們將面臨無血可輸?shù)木經(jīng)r。然而,目前RhD--缺失型的發(fā)生機(jī)制還不十分清楚,對其分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)及基因結(jié)構(gòu)更是知之甚少。1GTACGACTAGAAGGAAACCCCCACTCGGTTCCTACTGGGACTCTACCGACAGTGGTGTGACTGACGATGT先證者1-------------------------------------------------------C--------------先證者2----------------------------------------------------------------------71CGTATCATCCACAACTTGTACCGTAAGAAGGAAAGCTAACCTGAAGAGTCGTCTCGTCTCAACTGTGAAC先證者1------------------G---------------------------------------------------先證者2-----------------C----------------------------------------------------141CGGTC先證者1-----先證者2-----圖82位先證者外顯子5片段核苷酸序列與BN000065序列比較CcEe基因部分缺失主要表現(xiàn)為:RHD與RHCE基因部分外顯子重組,即RHCE基因中大部分外顯子被RHD基因某些外顯子所取代;RHCE基因多個外顯子完全缺失,而RHD基因基本正常,僅存在核苷酸的突變。通過PCR-SSP,我們發(fā)現(xiàn)兩家系成員均存在RHD基因第10外顯子與內(nèi)含子序列。兩位先證者缺失主要決定C/c抗原表達(dá)的RHCE基因第2外顯子序列,但是存在表達(dá)e抗原的第5外顯子序列,經(jīng)過測序發(fā)現(xiàn)2位先證者e片段存在核苷酸的突變和缺失。先證者1第5外顯子22位缺失C,而CAC編碼組氨酸(His),缺失可引起編碼氨基酸的密碼子框移,從而引起相應(yīng)蛋白質(zhì)的變化。若不考慮框移,48位由T>C,不會引起氨基酸的替換;90位由A>G,編碼的氨基酸則由甲硫氨酸替換成纈氨酸(m>v)。先證者2測序發(fā)現(xiàn)89位由T>C,其編碼的氨基酸由甲硫氨酸替換成丙氨酸(m>a)。先證者2的父親和姨媽沒有抗原e的表達(dá),但是擴(kuò)增后可以得到e抗原的相關(guān)序列,經(jīng)測序沒有發(fā)現(xiàn)核苷酸的改變。以上結(jié)果提示e抗原的缺失