鏈霉菌阿維菌素的分離、純化及生物活性

鏈霉菌阿維菌素的分離、純化及生物活性

1975年，日本北理研究所從靜岡區(qū)義東市河奈區(qū)的土壤樣本中分離出一條鏈霉菌（strepticma-4700）。發(fā)現(xiàn)該菌株的發(fā)芽液具有很高的抗腸道寄生蟲活性，對哺乳動物的毒性非常低。即使?jié)舛仍黾恿税吮?，也不會發(fā)現(xiàn)毒性。隨后,美國Merk公司從該菌發(fā)酵菌絲中提取出一族結(jié)構(gòu)相似的十六元大環(huán)內(nèi)酯類化合物,并命名為阿維菌素(avermectins,簡稱AVM)。AVM包含有8個結(jié)構(gòu)相似的天然組分,分別編號為A1a、A2a、A1b、A2b、B1a、B2a、B1b和B2b,其中A1a、A2a、B1a、B2a是大量組分,占總含量的80%以上;A1b、A2b、B1b、B2b是少量組分,占總含量的20%以下。B1組分的殺蟲活性最高,商品化的AVM即為B1a(≥80%)與B1b(≤20%)的混合物。1981年,阿維菌素作為獸藥投入市場,1985年作為農(nóng)藥投入市場。中國從20世紀(jì)80年代末開始對阿維菌素的研究,1994年臨時登記了第1個1.8%阿維菌素乳油,1996年登記了第1個阿維菌素原藥,到目前為止,約有30多家企業(yè)登記了阿維菌素原藥。阿維菌素是迄今發(fā)現(xiàn)的最有效的殺昆蟲劑、殺螨蟲劑和殺寄生蟲劑之一。1阿維菌素的調(diào)節(jié)作用與其他殺蟲劑不同,阿維菌素既不抑制膽堿酯酶,也不抑制蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等有機(jī)物的合成。AVM作用機(jī)制最初的解釋為:γ–氨基丁酸(GABA)是線蟲傳出神經(jīng)系統(tǒng)中的一種神經(jīng)遞質(zhì),當(dāng)神經(jīng)沖動到達(dá)神經(jīng)末梢時,神經(jīng)末梢的細(xì)胞膜釋放出GABA,作用于次級神經(jīng)元細(xì)胞膜或效應(yīng)器細(xì)胞膜,產(chǎn)生抑制效應(yīng),完成神經(jīng)沖動的傳遞過程。當(dāng)AVM進(jìn)入靶標(biāo)生物體后,表現(xiàn)為對GABA的激動作用,使神經(jīng)末梢細(xì)胞膜大量釋放GABA,并能促進(jìn)GABA與次級神經(jīng)元細(xì)胞膜或效應(yīng)器細(xì)胞膜的結(jié)合,產(chǎn)生長時間的高強(qiáng)度抑制效應(yīng),使線蟲麻痹死亡。但是后來研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)AVM濃度較低時,可引起與GABA系統(tǒng)無關(guān)的Cl–通道的開放。大量研究表明,AVM可引起谷氨酸控制的Cl–通道的開放,從而導(dǎo)致膜對Cl–通透性增加,帶負(fù)電荷的Cl–會引起神經(jīng)元休止電位的超極化,使正常的電動電位不能釋放,神經(jīng)傳導(dǎo)受阻,最終導(dǎo)致蟲體麻痹死亡。阿維菌素對哺乳動物有很強(qiáng)的選擇性。哺乳動物外周神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)為乙酰膽堿(Ach),以GABA作傳導(dǎo)介質(zhì)的神經(jīng)僅存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng),由于哺乳動物具有血腦屏障,因而藥物進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的數(shù)量很少。此外,至今尚未發(fā)現(xiàn)在哺乳動物體內(nèi)存在受谷氨酸控制的Cl–通道。因此,AVM對哺乳動物具有很高的安全性。2急性毒性藥大鼠毒理學(xué)研究表明,阿維菌素?zé)o三致作用(致畸、致癌、致突變)。急性毒性試驗結(jié)果表明,阿維菌素原藥(阿維菌素B1含量>95%)對大鼠急性經(jīng)口LD50為10~27mg/kg,按照中國農(nóng)藥毒性分級標(biāo)準(zhǔn),屬高毒殺蟲劑,原藥對小鼠急性經(jīng)口LD50為13mg/kg;兔急性經(jīng)皮LD50>2000mg/kg,大鼠急性經(jīng)皮LD50>380mg/kg;大鼠急性吸入雄性LD50為209.12mg/m3,中等毒性,雌性LD50為156.89mg/m3,高毒。對水生生物高毒,鱒魚96hLC50為3.6μg/L,藍(lán)鰓翻車魚96hLC50為9.6μg/L。對蜜蜂高毒,經(jīng)口LD50為0.009g/頭,接觸LD50為0.002g/頭,但殘留在葉面的LT50為4h,4h以后殘留在葉面的藥劑對蜜蜂低毒。對鳥類低毒,鵪鶉急性經(jīng)口LD50為86.4mg/kg,鴿子為537mg/kg。3關(guān)于療效的研究3.1阿維菌素對2齡幼蟲的滲透能力阿維菌素對多種植物線蟲均有較好的控制作用。1.8%阿維菌素乳油對南方根結(jié)線蟲具有很強(qiáng)的殺線活性。1.8%阿維菌素乳油質(zhì)量濃度為10、5、2.5、1.25、0.625mg/L時,對南方根結(jié)線蟲的校正死亡率分別為80.47%、69.51%、58.87%、47.80%和35.13%。藥劑處理24h,阿維菌素對南方根結(jié)線蟲的LC50值為1.48mg/L。阿維菌素對南方根結(jié)線蟲的毒殺作用隨處理時間延長而增大。阿維菌素處理2齡幼蟲2、24、48h后,LD50分別為63.6051、8.5111和7.3461μg/mL。阿維菌素抑制2齡幼蟲的侵入能力,線蟲侵染率隨藥劑濃度增大而降低。阿維菌素0.5、2μg/mL處理根結(jié)線蟲,48h后2齡幼蟲對番茄根部的侵入率分別為8.32%、0.12%,而對照處理線蟲的侵入率為21.85%。阿維菌素(24h)對南方根結(jié)線蟲、腎形線蟲的致死中濃度分別為1.56μg/mL和32.9μg/mL,阿維菌素還可降低南方根結(jié)線蟲、腎形線蟲對番茄的侵染力。阿維菌素對松材線蟲具較強(qiáng)的殺滅作用,且對松材線蟲的繁殖也有較強(qiáng)的抑制作用。阿維菌素50、500μg/mL處理24h后,線蟲校正死亡率分別為83.05%、95.96%。500μg/mL阿維菌素處理5d后,線蟲繁殖抑制率為100%。阿維菌素與硫酸銅聯(lián)合使用對松材線蟲毒性增強(qiáng)。阿維菌素和吡蟲啉聯(lián)合染毒,也對松材線蟲表現(xiàn)出增效作用。阿維菌素對甘薯莖線蟲和穿刺短體線蟲均有較好的殺滅效果。阿維菌素400mg/L以下時,河北省昌黎、涿州、盧龍和撫寧4地甘薯莖線蟲的死亡率均在45%以下,但當(dāng)用量增大到600mg/L時,其死亡率陡增,達(dá)到90%以上。阿維菌素不同濃度處理穿刺短體線蟲0.5h后,線蟲校正死亡率隨處理濃度升高而增加,當(dāng)阿維菌素濃度為200mg/mL時,供試線蟲校正死亡率達(dá)到100%。處理濃度不變,延長處理時間可提高穿刺短體線蟲的校正死亡率。3.2阿維菌素防治新疆楊線蟲的效果阿維菌素有種子處理、播前或定植前穴施、生長期灌根、葉面噴施、植株根部注射等多種田間施藥方式。1.8%阿維菌素乳油600mL/hm2播前毒土處理,對黃瓜根結(jié)線蟲病的防效為59.38%。阿維菌素播前1mL/m2表面噴施(土壤混合施藥),西瓜根結(jié)線蟲病的病情指數(shù)、根結(jié)數(shù)量、根結(jié)重/根重分別比對照降低47.04%、48.32%、23.47%。0.5%阿維菌素顆粒劑播前施藥2000、3000、3500g/667m2,對黃瓜根結(jié)線蟲病的防效為66.61%~74.63%;定植前穴施3000、3250、3500g/667m2,防效分別為67.1%、72.1%、78.6%。1.8%阿維菌素乳油3000mL/hm2灌根,對不同作物上南方根結(jié)線蟲的平均防效為76%~82%。番茄定植30d后,2%阿維菌素1000倍液50mL灌根處理,40d后對根結(jié)線蟲的防治效果為66.3%。香蕉莖基部注射阿維菌素,可以有效控制爪哇根結(jié)線蟲和香蕉相似穿孔線蟲的侵染。線蟲接種28d或56d后注射施藥,阿維菌素(250、500μg/株)對爪哇根結(jié)線蟲和香蕉相似穿孔線蟲均表現(xiàn)出顯著防效。1.2%阿維菌素微膠囊懸浮劑按病樹胸徑每厘米用藥0.08、1.0、1.2mL,60d后對松材線蟲的防治效果分別為73.33%、86.66%、93.33%。阿維菌素不同用藥方式對線蟲防治效果有差異。25%阿維菌素乳油1000倍液灌根,施藥7、15、25d后新疆楊線蟲平均減退率分別為64.5%、60.8%、53.7%;而阿維菌素1500g/hm2土壤處理,防治7、15、25d后,線蟲平均減退率分別為39.6%、22.4%、8.8%。防治新疆楊線蟲,根灌效果好于土壤處理。阿維菌素處理種子,可以減少線蟲對植物的侵染,同時促進(jìn)植株生長。阿維菌素100g/100kg處理棉花種子,定植35d后,棉花根部根結(jié)線蟲卵數(shù)為8472,比對照降低73.82%;株高23.1cm,比對照增加22.87%。阿維菌素0.1mg處理種子,玉米短體線蟲和棉花上南方根結(jié)線蟲的減退率均達(dá)80%以上,0.3mg處理,甜菜異皮線蟲的減退率為60%。1.8%阿維菌素可濕性粉劑5g/100kg拌種大豆種子,大豆苗期根數(shù)、株高和單株鮮重分別較對照增加16.25%、18.60%和4.94%;大豆產(chǎn)量增加5.56%。目前,市售阿維菌素有乳油、顆粒劑、可濕性粉劑、粉劑等不同劑型,同一劑型的有效成分含量又有不同。不同含量、不同劑型的阿維菌素處理均可以很好地控制植物線蟲。1.8%阿維菌素乳油15L/m2處理溫室土壤,藥后90d土壤中黃瓜根結(jié)線蟲、番茄根結(jié)線蟲2齡幼蟲數(shù)量減退率分別為10.04%、75.68%,防效分別為46.5%、62.87%;用量20kg/hm2,藥后60、90d對苦瓜根結(jié)線蟲的防治效果分別為62.7%、50.5%。2%阿維菌素乳油1000倍液處理播前土壤,藥后45d牛蒡根結(jié)線蟲蟲口減退率為68.5%,病情指數(shù)下降52.34%。10%阿維菌素顆粒劑3kg/667m2拌土溝施,對黃瓜根結(jié)線蟲的防治效果為71.17%。0.26%阿維菌素粉劑2.25、3.0、4.0kg/667m2,藥后20d對花生根結(jié)線蟲病的防效分別為54.1%、74.1%、68.2%;藥后45d的防效分別為66.7%、85.2%、81.5%。1.8%阿維菌素乳油用量0.1、0.15、0.2mL,對香蕉穿孔線蟲的防效分別為92.78%、94.35%、96.09%;0.5%阿維菌素顆粒劑用量3、3.5、4g,對香蕉穿孔線蟲的防效分別為98.26%、99.39%、100%。1.8%阿維菌素乳油、0.5%阿維菌素顆粒劑對香蕉穿孔線蟲均表現(xiàn)良好的防治效果,兩者差異不顯著。0.5%阿維菌素顆粒劑45kg/hm2拌沙溝施,能抑制半穿刺線蟲在土壤中和根上的蟲口密度,對土壤中和根上蟲口的平均防效分別為68.65%和65.89%。24.5%阿維菌素乳油2000倍液1800L/hm2淋根,可顯著抑制半穿刺線蟲在土壤中和根上的蟲口密度,對土壤中和根上蟲口的平均防效分別為75.90%和74.39%。阿維菌素對草莓滑刃線蟲的控制效果因寄主植物而異。阿維菌素0.005g/L處理,對侵染紫花野芝麻的草莓滑刃線蟲防效達(dá)81.23%以上;用量增大到0.011g/L,仍不能控制侵染比利時杜鵑和秋海棠的草莓滑刃線蟲。阿維菌素對線蟲的防效隨用藥次數(shù)增加而增大。阿維菌素不僅能夠很好地控制植物寄生線蟲,并且能夠促進(jìn)植株生長。阿維菌素對胡椒根結(jié)線蟲、榕樹根結(jié)線蟲均有較好的防治效果。阿維菌素不同劑量處理均能減少植株根部卵囊、雌蟲數(shù)量、根結(jié)數(shù)及土壤中2齡幼蟲數(shù)量。高濃度1.5×10–3處理,油菜株高增長率最高19.1%,莖鮮重增長率中等,為42.6%;中濃度1.0×10–3處理,油菜株高增長率中等,為15.7%,莖鮮重增長率最高,為52.8%。將鱗球莖莖線蟲置于阿維菌素稀釋液中(0.018、0.036、0.072g/L)浸泡4h,50%線蟲失去活動力。將浸泡后線蟲接種大蒜,與對照相比,阿維菌素0.072g/L處理,每平米蒜株數(shù)增加3.20%,大蒜橫徑增大,大蒜產(chǎn)量增加12.87%,且線蟲侵染率僅為7%。小麥返青期溝施0.5%阿維菌素顆粒劑30kg/hm2,小麥校正胞囊減退率最大(55.13%),且增產(chǎn)效果好,增產(chǎn)率為18.54%;60kg/hm2處理后小麥株高平均值最大(59.32cm),植株增高明顯。1.8%阿維菌素乳油3000倍液澆窩,對甘薯莖線蟲的防治效果為77.3%,薯塊增產(chǎn)12.9%。1.8%阿維菌素乳油0.99mL/m2,藥后49d栝樓根結(jié)線蟲2齡幼蟲蟲口減退率為89.6%;藥后124d,栝樓增果率為250%。阿維菌素作用機(jī)制獨特,且具有較長的持效期。香蕉莖基部注射阿維菌素,藥劑在香蕉樹中持效期至少可達(dá)56d。香蕉施藥(100μg/株)28d后分別接種爪哇根結(jié)線蟲和香蕉相似穿孔線蟲,28d后,阿維菌素對2種線蟲的控制效果仍分別高達(dá)100%和84.46%。2%阿維菌素乳油稀釋500倍液灌根,12周后對盆景根圍的植物病原線蟲減退率高達(dá)95.2%。2%阿維菌素乳油連續(xù)2年在16棵黑松上注干防治松材線蟲,注藥量400mL/m3(60mL/株),第1年對松材線蟲的防效達(dá)到100%,第2年為88%,持效期2年。取樣檢查樹體內(nèi)線蟲,距地面4m處的樹干內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)任何線蟲,說明藥劑被注入樹干的芯材部位后,可擴(kuò)散到樹體的上部。1.8%阿維菌素乳油40mL/m2拌毒土,藥后45、70d對黃瓜根結(jié)線蟲的防效分別為62.9%、13.2%;天線一號(0.5%阿維菌素可濕性粉劑)2.5kg/667m2拌土,藥后45、70d對黃瓜根結(jié)線蟲的防效分別為69.6%、77.1%,阿維菌素可濕性粉劑持效期較乳油好。阿維菌素對根結(jié)線蟲的防效優(yōu)于常規(guī)殺蟲劑。阿維菌素、噻唑磷、滅線磷、敵敵畏、吡蟲啉、毒死蜱、敵百蟲對根結(jié)線蟲的防效分別為35%、27%、20%、20%、20%、20%、13%,1.8%,阿維菌素防治效果最好。將阿維菌素與其他化學(xué)藥劑聯(lián)合使用可以提高單劑的防治效果。0.2%阿維菌素和3%吡蟲啉、1%阿維菌素和1%苦參堿2個藥劑組合林間注干施藥(施藥劑量2mL/cm胸徑)防治松材線蟲,第1年防治效果均為100%,第2年防效分別為