三堿性磷酸酶的分離純化和Km測定

其次局部堿性磷酸酶Km測定一、試驗目的把握堿性磷酸酶的的動力學鑒定—Km鑒定二、試驗原理當溫度、pH及酶濃度恒定的條件下，酶促反響的初速度隨作用物濃度[S]增大而增大，但增大到肯定限度時，作用物濃度再增加，則反響速度不再增加。此時反響速度為最大速度〔Vmax〕。MichaelisMenten對酶促反響速度與作用物濃度之間的這種關系進展了大量試驗爭論，并于1913年提出了數(shù)學方程式，即著名的米一曼方程式：

作圖后，將各點連線延長，直線與橫軸的交點為1/Km，依據(jù)在橫軸上的截距，可以計算出該酶的Km。

本試驗以堿性磷酸酶為例，用磷酸苯二鈉為其作用物，堿性磷酸酶能分解磷酸苯二鈉產(chǎn)生酚和磷酸，酚在堿性溶液中與4-氨基安替比林作用，經(jīng)鐵氰化鉀氧化生成紅色的醌衍生物，依據(jù)紅色深淺可測出酶活力凹凸。其反響式如下：

磷酸苯二鈉磷酸鹽+酚AKP酚+4-氨基安替比林紅色醌類衍生物鐵氰化鉀PH10堿性利用在不同作用物濃度的條件下，測定的酶活性〔A〕，按Lieweaver-Burk二氏法作圖，從x軸上的截距求得其Km值。三、試驗儀器及試劑儀器：恒溫水浴鍋，721型分光光度計。試劑：

1.0.04mol/L作用物液：稱取10.16g磷酸苯二鈉〔C6H5PO4Na2·2H2O〕，用煮沸后冷卻的蒸溜水溶解，并稀釋至1,000ml，4ml氯仿防腐，加貯于棕色瓶內(nèi)，置冰箱內(nèi)保存，可用一周。

2.0.1mol碳酸鹽緩沖液〔pH10.0〕：稱取無水碳酸鈉6.36g及碳酸氫鈉3.36g，溶解于蒸餾水中，并稀釋至1,000ml.

3.堿性磷酸酶液：用自己提取的堿性磷酸酶液，用

pH10緩沖液稀釋

5-7倍。0.5mol/LNaOH

溶液0.3%4-氨基安替比林：稱取

3g4氨基安替比林及碳酸氫鈉

42g，用蒸餾水溶解，并稀釋至

1,000ml，貯于棕色瓶中，放冰箱內(nèi)保存。0.5%鐵氰化鉀：稱取

10g鐵氰化鉀及

30g硼酸各溶于

800ml蒸餾水中，溶解后兩液混合加水至

2,000ml。置棕色瓶中，放冰箱內(nèi)保存。四、操作步驟1、取大試管

7支，按下表操作：參加酶液，混勻之后馬上計時，各管在37℃水浴中準確保溫15分鐘后，立即參加0.5MolNaOH液1.0ml以終止反響。

2、顯色：各管中參加0.3%4氨基安替比林1.0ml和0.5%鐵氰化鉀2.0ml，充分混勻，放置10分鐘，以0管為比照，在波長510nm下比色，記錄各管的吸光度。3、作圖：所測各管的吸光度代表各管中反響速度V，以之為縱軸，以作用物濃度[S]為橫軸，在坐標紙上連接各點作圖，觀看曲線的外形。以各管吸光度值的倒數(shù)為縱坐標，以作用物濃度的倒數(shù)為橫坐標，作圖并求此酶的Km值。五、試驗結(jié)果〔1〕說說堿性磷酸酶提取過程中的留意事項〔2〕計算堿性磷酸酶的Km值單項選擇題：1．下面關于酶的描述，哪一項不正確：A

A、全部的酶都是蛋白質(zhì)

B、酶是生物催化劑

C、酶具有專一性

D、酶是在細胞內(nèi)合成的，但也可以在細胞外發(fā)揮催化功能2．一個簡潔的米氏酶催化反響，當[S]<<Km時：B

A、反響速度最大

B、底物濃度與反響速度成正比

C、增加酶濃度，反響速度顯著變大

D、[S]濃度增加，Km值也隨之變大3．酶的比活力是指：B

A、任何純酶的活力與其粗酶的活力比

B、每毫克蛋白的酶活力單位數(shù)

C、每毫升反響混合液的活力單位

D、以某種酶的活力作為1來表示其他酶的相對活力是非題：1．假設有一個適