鏈脲佐菌素結(jié)合高糖高脂飲食誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠模型的建立

鏈脲佐菌素結(jié)合高糖高脂飲食誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠模型的建立

隨著社會(huì)老齡化和生活方式的改變，2型糖尿?。╰2dt）的發(fā)病率逐年增加。糖尿病的病因至今尚未完全闡明,目前認(rèn)為主要是胰島素抵抗(IR)、胰島β細(xì)胞功能衰竭和胰島素分泌障礙,而胰島素抵抗(IR)是T2DM的重要特征。為研究糖尿病形成的病因,利用合適的糖尿病動(dòng)物模型無(wú)疑可對(duì)人類糖尿病研究提供重要線索,可以解決許多在糖尿病患者臨床上所不能解決的問(wèn)題,因而是十分必要的。目前,國(guó)內(nèi)多采用鏈脲佐菌素加高脂高糖飼料喂養(yǎng)法復(fù)制T2DM模型。以往的研究報(bào)道中,高脂高糖喂養(yǎng)時(shí)間為4周到10周不等,STZ注射劑量為25~90mg/(kg·bw),高脂高糖喂養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),導(dǎo)致試驗(yàn)周期過(guò)長(zhǎng);STZ劑量偏大,試驗(yàn)動(dòng)物胰島β細(xì)胞破壞過(guò)多,則更傾向于Ⅰ型糖尿病的表型特點(diǎn),影響研究結(jié)果,而且死亡率增加。該試驗(yàn)通過(guò)喂飼高脂高糖飼料4周加鏈脲佐菌素[30mg/(kg·bw)]對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射,建立一種較佳的類似人類T2DM的動(dòng)物模型。通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)大鼠胰腺組織磺脲類藥物受體1(sulfonylureareceptor1,SUR1)mRNA的表達(dá),初步探討糖尿病發(fā)病的分子機(jī)制。1材料和方法1.1性別間的合作SPF級(jí)SD大鼠,體質(zhì)量(200±20)g,30只,雄性。購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào):SCXK(粵)2008-0020。1.2儀器和試劑鏈脲佐菌素(STZ,晶欣生物科技公司,LOT:120705)、胰島素(Insulin,INS)ELISA試劑盒(CUSABIOBIOTECHCO.,LTD,LOT:U28071539)、血糖檢測(cè)試劑盒(四川邁克生物科技股份有限公司,批號(hào):1010131)、cDNA試劑盒(Fermentas公司,LOT:00093395)、Trizolreagent(Invitrogen公司,LOT:15596-026)、氯仿(>99.8%)美國(guó)Sigma公司,LOT:20110802-1)、DL2000DNAMaker(博大泰克MK-4,LOT:039)、AgaroseLE(MDBio,Inc.西班牙,LOT:NO.111760)、TaqDNA聚合酶(上海申能博彩生物科技有限公司,E2300)、EB(廣州威佳科技有限公司,LOT:136318431108049)、Tris(TheDowChemicalCompany,LOT:W422000)、EDTA·2Na·2H2O(MBCHEM,LOT:2246122)、冰醋酸(廣州化學(xué)試劑廠,20110601-2)、DEPC(diethylpyrocarbonate,焦碳酸二乙酯,美國(guó)Sigma公司,LOT:110610)、引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。1.3pcr擴(kuò)增及成像系統(tǒng)簡(jiǎn)介電子血糖分析儀(OneTouchUltra,穩(wěn)豪血糖儀)、全自動(dòng)生化儀(日立,7096型)、超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore,Rios5+Milli-Q-B)、多功能PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ThermoHybaid,PXⅡ)、電泳系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD,Mini-SubCell)、凝膠成像及分析系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD、GelDoc)、酶標(biāo)儀(美國(guó)ThermoLABSYSTEMS)、超低溫冰箱(美國(guó)ThermoForma,702)。1.4花東信華動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)普通飼料及高脂飼料均購(gòu)于廣東省廣州市花都區(qū)花東信華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)。高脂高糖飼料配方:18%豬油、20%蔗糖、3%蛋黃粉、59%基本飼料。1.5方法1.5.1組將30只SPF級(jí)SD大鼠購(gòu)回后,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,無(wú)異常發(fā)現(xiàn)者,隨機(jī)分成2組:正常組10只,模型組20只。1.5.2stz的注射空白組大鼠給予普通飼料,模型組大鼠給予高脂高糖飼料,喂養(yǎng)4周。4周后將STZ組大鼠禁食不禁水12h后,腹腔注射STZ[30mg/(kg·bw)]。STZ注射5d后,對(duì)注射STZ的大鼠測(cè)定尾靜脈隨機(jī)血糖,認(rèn)為隨機(jī)血糖>16.7mmol/L者為2型糖尿病造模成功。1.5.3rt-pcr檢測(cè)每日8:00—10:00對(duì)大鼠進(jìn)行一般狀態(tài)觀察。每周記錄1次體質(zhì)量。大鼠腹腔注射10%水合氯醛,眼眶靜脈叢采血,3000r/min,離心10min,取上清,-80℃冰箱保存。檢測(cè)注射STZ后1、4、8、12周的空腹胰島素(INS)、血糖(BG)的含量,計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(insulinsensitivityindex,ISI)。其中,BG測(cè)定用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè),INS測(cè)定用ELISA方法,具體按說(shuō)明書操作,根據(jù)酶標(biāo)儀檢測(cè)得到樣品的吸光值(檢測(cè)波長(zhǎng)為450nm),利用標(biāo)準(zhǔn)曲線的二次方程式計(jì)算得出待檢樣品中INS的濃度。12周麻醉后處死動(dòng)物,剝離并摘取胰腺,迅速提取總RNA,檢測(cè)濃度后進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)SUR1mRNA的表達(dá)。設(shè)β-actin為內(nèi)參照。取40μg/mL的RNA,反應(yīng)體系為25μL,循環(huán)參數(shù):95℃3min,94℃30s,54℃30s,72℃45s,72°C10min,共33循環(huán)進(jìn)行RT-PCR。取5μLRT-PCR產(chǎn)物,經(jīng)20g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定,利用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析SUR1基因與內(nèi)參β-actin的光吸收比值。RT-PCR引物用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì),由上海生物工程技術(shù)有限公司合成,序列為SUR1的上游引物5′AGAGCGAGGAAGATGACA3′,下游引物5′ACAGTGACAGAGGTGACA3′,預(yù)期大小322bp;β-actin的上游引物5′CCATTGAACACGGCATTG3′,下游引物5′TACGACCAGAGGCATACA3′,預(yù)期大小234bp。重復(fù)檢測(cè)3次。1.5.4統(tǒng)計(jì)處理2結(jié)果STZ注射后,有2只大鼠未成模,模型組有3只大鼠死亡。2.1大鼠的一般狀態(tài)2.2體重和體重變化喂養(yǎng)4周后,空白組體重(321.63±26.59)g,模型組體重(346.63±34.44)g,與空白組比較,體重增加,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。注射STZ后,模型組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的體重比空白組輕,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組大鼠體重比較結(jié)果見表1。2.3g、isi檢測(cè)注射STZ后1、4、8、12周,模型組BG值均明顯升高,與空白組比較,P<0.01;ISI均明顯降低,與空白組比較,P<0.01。兩組大鼠血糖及胰島素比較結(jié)果見表2。2.4從反應(yīng)的方法上看RT-PCR擴(kuò)增β-actin、SUR1基因片段后,20g/L瓊脂糖凝膠檢測(cè)到234bp和322bp2個(gè)條帶的產(chǎn)物(見圖1和圖2)。通過(guò)凝膠成像掃描系統(tǒng)做半定量分析,以SUR1mRNA與β-actin的吸光度比值作為該產(chǎn)物的絕對(duì)值。結(jié)果顯示(見表3),細(xì)胞內(nèi)的SUR1mRNA含量模型組明顯低于空白組(P<0.01)。3sur1基因多態(tài)性對(duì)tmd的影響T2DM的發(fā)病機(jī)制包括胰島素抵抗和β細(xì)胞分泌功能障礙,英國(guó)對(duì)糖尿病的前瞻性研究表明,β細(xì)胞功能衰退是T2DM發(fā)生和進(jìn)展的主要驅(qū)動(dòng)力,因此,研究β細(xì)胞功能相關(guān)基因具有重要意義。已有研究表明,有多種基因與β細(xì)胞功能相關(guān),如SUR1基因、解偶聯(lián)蛋白2基因、胰高血糖素樣肽1基因等。SUR1基因是胰島β細(xì)胞膜ATP敏感鉀通道(KATP)的調(diào)節(jié)亞單位。它在胰島素釋放過(guò)程中有生理性調(diào)節(jié)作用,當(dāng)血糖濃度波動(dòng),使細(xì)胞內(nèi)ATP/ADP比例改變時(shí),可通過(guò)SUR1基因調(diào)節(jié)ATP敏感的鉀通道開關(guān),進(jìn)而影響胰島素的分泌,成為胰島素分泌缺陷和2型糖尿病易感性的潛在候選基因。在對(duì)SUR1基因的多態(tài)性與T2DM發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用還存在爭(zhēng)議,國(guó)外對(duì)它與T2DM具有或不具有相關(guān)性的結(jié)論均有報(bào)道,對(duì)中國(guó)漢族人群的研究結(jié)果也不盡一致,還需要進(jìn)行更大樣本的糖尿病人群的研究,以明確該基因是否為T2DM的易感基因之一。該研究中,采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周后,一次性腹腔注射STZ[30mg/(kg·bw)],5d后,對(duì)注射STZ的大鼠測(cè)定尾靜脈隨機(jī)血糖,認(rèn)為隨機(jī)血糖>16.7mmol/L者為2型糖尿病造模成功,成模率為75%,與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果接近。注射STZ后1~12周,模型組BG均明顯升高,ISI均明顯降低,符合2型糖尿病的特點(diǎn)。通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)注射STZ后第12周SUR1mRNA表達(dá)的變化,發(fā)現(xiàn)模型組SUR1mRNA表達(dá)明顯下降,與空白組比較P<0.01。可能是由于STZ直接破壞胰島β細(xì)胞,使得胰島內(nèi)β細(xì)胞數(shù)目大大減少,同時(shí)β細(xì)胞的生理功能也會(huì)受到影