豬源鏈球菌溶血素的測(cè)定與分析

豬源鏈球菌溶血素的測(cè)定與分析

豬鏈霉菌受到嚴(yán)重影響，是中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)多年來最常見的疾病之一。1998年夏,江蘇某地豬群暴發(fā)了豬鏈球菌2型(Streptococcussuistype2)引致的急性敗血性傳染病,死亡率達(dá)39.7%,造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,并對(duì)人民健康造成了嚴(yán)重威脅。本試驗(yàn)在對(duì)近幾年從江蘇和上海地區(qū)分離的豬源鏈球菌的溶血活性進(jìn)行了檢測(cè)。1材料和方法1.1馬球獸疫物種streptocco權(quán)從江蘇、上海等地的病豬分離豬源鏈球菌13株、1株豬鏈球菌2型參考菌株SS2-D(德國(guó)吉森大學(xué)Baljer教授惠贈(zèng))、5株馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcusequisubsp.zooepidemicus)菌株,后者屬鏈球菌蘭氏(Lancefield)分群C群,系從患敗血癥死亡的病死豬分離,其中ATCC35246(以下簡(jiǎn)稱35246),購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心,其余4株由上海市畜牧獸醫(yī)站提供。菌株來源等參見表2。1.2種子液培養(yǎng)模式挑取35246單菌落,接種于THB,37℃靜置培養(yǎng)18～24h制成種子液。試驗(yàn)時(shí)按1%的比例移種至不同培養(yǎng)基中,置不同條件下培養(yǎng)。溶血價(jià)的測(cè)定按文獻(xiàn)的方進(jìn)行(下同)。1.2.1血清濃度將種子液分別接種于THB、2%血清THB(含2%犢牛血清的THB,下同)和5%血清THB,置37℃靜置培養(yǎng)12h測(cè)溶血價(jià)。1.2.2營(yíng)養(yǎng)豬肉和血清丁血的測(cè)定將種子液分別接種于5%血清THB、5%血清營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)、5%血清馬丁肉湯(MB),置37℃靜置培養(yǎng),接種后6,12,18,24,30,36和48h分別取樣測(cè)溶血價(jià)。1.2.3堿性將種子液分別接種于pH為6.5,7.0,7.5,8.0和8.5的5%血清THB,37℃靜置培養(yǎng)12h,測(cè)溶血價(jià)。1.2.4氣體環(huán)境將種子液接種至5%血清THB(pH為7.5)后,分別在振蕩通氣(110r/min)及靜置氣體環(huán)境下培養(yǎng)12h,測(cè)溶血價(jià)。1.3豬源鏈的溶血性檢測(cè)1.3.1血液中脂酸將各菌株劃線接種于5%兔鮮血瓊脂平板,置37℃培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。菌落周圍出現(xiàn)溶血圈者,判為溶血陽性。1.3.2疫種和豬鏈球菌的溶血素檢測(cè)按照1.2部分確定的條件和文獻(xiàn)報(bào)道的方法,分別檢測(cè)馬鏈球菌獸疫亞種和豬鏈球菌2型的溶血素,即將各待測(cè)菌株接種于THB中,于37℃培養(yǎng)18～24h制成種子液,然后按1%的接種量分別接種于THB和含5%犢牛血清的THB中,置37℃培養(yǎng)12h后測(cè)血價(jià)。1.3.3各種溶劑溶劑對(duì)血溶膠的影響在各菌株5%犢牛血清THB培養(yǎng)液上清中分別加入還原劑二硫代蘇糖醇(DTT)(上海大境生化制品經(jīng)營(yíng)部)、氧化劑過氧化氫(南京金陵化工廠)、溶血抑制劑膽固醇(上海生物化學(xué)試劑公司)、卵磷脂(華東師范大學(xué)化工廠),使之終濃度分別為5mmol/L,0.1%(v/v),100g/mL,100g/mL置室溫(25℃)作用30min后,分別測(cè)溶血價(jià)。2結(jié)果2.1培養(yǎng)條件對(duì)馬草酸亞洲酚的產(chǎn)量的影響2.1.1血清濃度35246在THB、2%血清THB和5%血清THB中的溶血價(jià)分別為0、32和64。2.1.2血清nb、血清b中血清mb中最低培養(yǎng)基的種類對(duì)溶血素產(chǎn)量影響極大,在5%血清THB中最高,達(dá)64,其次為5%血清MB,達(dá)16,5%血清NB中最低,僅為4。培養(yǎng)時(shí)間對(duì)溶血素的產(chǎn)量影響也很大,其產(chǎn)量在接種后12h,達(dá)到高峰(表1)。2.1.3血清thb蛋白表達(dá)情況35246在pH為6.5,7.0,7.5,8.0和8.5的5%血清THB中的溶血價(jià)分別為8,16,64,32,16和4,可見pH為7.5時(shí),溶血價(jià)最高。2.1.4氣體環(huán)境對(duì)溶血素產(chǎn)量的影響在靜置條件下培養(yǎng)溶血價(jià)為64,而在振蕩通氣條件下,溶血價(jià)僅為16。2.2配用mthb的活性所有7株豬鏈球菌2型菌株在血平板上的溶血性較弱,僅為α或弱β溶血,但在THB和5%血清THB中都可產(chǎn)生很強(qiáng)的溶血性;其溶血性可被還原劑活化,被氧化劑和膽固醇所抑制,卵磷脂對(duì)其活性則沒有影響。9株馬鏈球菌獸疫亞種菌株在血平板上的溶血性很強(qiáng),呈顯著的β溶血,在不含血清THB中不能產(chǎn)生溶血性,在含血清的THB中可產(chǎn)生較強(qiáng)的溶血性,其活性不被還原劑活化,不被氧化劑抑制,被膽固醇抑制大部分活性,而被卵磷脂全部抑制。非典型C群鏈球菌上海分離株SH0066531和SH0066532在血平板上呈顯著的β溶血,在液體培養(yǎng)條件下顯示了非常強(qiáng)的溶血性,溶血價(jià)達(dá)512,而且其活性不被還原劑活化、不被氧化劑抑制,也不被卵磷脂抑制,但被膽固醇強(qiáng)烈抑制。檢測(cè)結(jié)果見表2。3溶血素的致病性檢測(cè)很多鏈球菌都可產(chǎn)生溶血素,其中A群鏈球菌溶血素的研究較深入。A群鏈球菌可產(chǎn)生兩種溶血素,一種對(duì)氧敏感,遇氧失活,稱為SLO(StreptolysinO),另一種對(duì)氧不敏感,稱為SLS(StreptolysinS)。SLO能被膽固醇強(qiáng)烈抑制,SLS只在含有SLS誘生劑如血清、RNA的培養(yǎng)基中才能產(chǎn)生,SLS被膽固醇抑制部分活性,被卵磷脂和臺(tái)盼藍(lán)強(qiáng)烈抑制。根據(jù)本試驗(yàn)溶血素檢測(cè)的結(jié)果,可判定本試驗(yàn)所測(cè)的8株豬鏈球菌2型菌株的溶血素屬于巰基活化類(類SLO)溶血素,9株馬鏈球菌獸疫亞種菌株所產(chǎn)生的溶血素屬于類SLS,還有兩株非典型C群鏈球菌所產(chǎn)生的溶血素屬于非SLO、非SLS溶血素。馬鏈球菌獸疫亞種曾經(jīng)是我國(guó)豬鏈球菌病的主要病原,但其產(chǎn)生的溶血素屬于何種類型的溶血素,一直未見報(bào)道。本試驗(yàn)表明,馬鏈球菌獸疫亞種豬分離株溶血素屬于類SLS溶血素,與Suzuki報(bào)道的馬鏈球菌獸疫亞種松鼠分離株以及Flangan報(bào)道的馬鏈球菌馬亞種的溶血素的一致。盡管馬鏈球菌獸疫亞種的3個(gè)菌株35246、JS01和ST171的毒力差異很大,對(duì)小鼠的LD50分別為104.0、105.5和107.3(待發(fā)表資料),但本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)它們?cè)谘桨迳虾鸵后w培養(yǎng)基中的溶血性都沒有明顯差異,提示該菌除溶血素外,可能還有其它重要致病因子。溶血素是細(xì)菌一種常見的致病因子,對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確、快速的檢測(cè),具有很大的實(shí)際意義。溶血素檢測(cè)方法最常用的為平板法和上清法。平板法是一種最簡(jiǎn)便的方法,但具有很大的局限性。例如,豬鏈球菌2型在血平板上的溶血性比馬腺疫鏈球菌獸疫亞種弱很多,但在各自最合適的液體