高脂油水平衡培養(yǎng)尖狀柵藻的研究

高脂油水平衡培養(yǎng)尖狀柵藻的研究

0微藻在廢水處理方面的應用能源危機不僅導致依賴化石能源的全球經(jīng)濟發(fā)展停滯，而且導致了以爭奪原油為目的的全球戰(zhàn)爭?；剂先紵欧诺膹U氣及其引發(fā)的極端氣候已經(jīng)給全人類造成嚴重的生命危害和巨額的財產(chǎn)損失~。因此,尋求經(jīng)濟、環(huán)保的可再生替代燃料是解決石油危機和應對全球氣候變化的迫切需求。生物柴油的本質是單烷基脂肪酸酯,與石化柴油相比,其分子內基本不含硫和芳烴,大大降低燃燒排放物中的有毒成分。微藻通過光合作用能夠在細胞中積累大量油脂,通常為干重的20%~50%。研究表明,微藻油脂在脂肪酸碳鏈組成上同其他高等油料植物相似,且微藻藻油中的儲藏性油脂主要為三酰甘油(TAG),是生產(chǎn)生物柴油的理想原料。人類生產(chǎn)、生活中所產(chǎn)生的未經(jīng)處理或稍經(jīng)處理的工業(yè)廢水和生活污水排放后,會將過多的營養(yǎng)物質,尤其是氮、磷等攜帶進入自然水體,引起水體富營養(yǎng)化,造成水質的污染和水體生態(tài)環(huán)境的嚴重破壞~。微藻生長過程中能夠吸收利用廢水中的氮和磷很早就引起了人們的關注,1957年,Oswald提出了利用微藻去除水體中營養(yǎng)鹽的觀點。半個世紀以來,大量的研究證明,微藻在廢水處理,尤其是氮、磷等營養(yǎng)鹽去除的可行性。利用微藻處理廢水時所產(chǎn)生的生物質可用于生物燃料的生產(chǎn),該過程能同時滿足人類保護環(huán)境與開發(fā)清潔能源的需求,是一個雙贏的過程。本文以一株新近分離的富含油脂淡水綠藻———尖狀柵藻(S.acuminatus)為研究材料,比較了其在BG-11培養(yǎng)基中和奶牛場廢水中的生長、油脂積累規(guī)律和廢水中氮、磷去除效率,研究結果可為利用微藻處理廢水和生產(chǎn)生物燃料提供理論依據(jù)和技術參考。1材料和方法1.1材料表面1.1.1生物技術與生物能源實驗室尖狀柵藻(Scenedesmusacuminatus)采自暨南大學南湖,由暨南大學水生生物研究所微藻生物技術與生物能源實驗室保藏。1.1.2微藻的過濾和培養(yǎng)廢水采自河南省新鄉(xiāng)市某養(yǎng)殖場。將其沉淀后,用紗布過濾上清液,去除廢水中的大顆粒固體及懸浮物后儲存于超低溫冰箱(-80℃),用于微藻培養(yǎng)。1.1.3主試劑和設備過硫酸鉀、硫酸、苯酚、氫氧化鈉、蛋白試劑盒、丙酮、甲醇、硫酸、乙醇、乙醚、二甲基亞砜、正己烷、氮氣、二氧化碳等。(2)儀器、試驗裝置高壓蒸汽滅菌鍋(D-1),超凈工作臺(SWCJ-1F),恒溫震蕩培養(yǎng)箱(ZQWY-200G),恒溫干燥箱(Binder),高速冷凍離心機(SORVALLbiofuge),冷凍干燥機(VirTiswizard2.0),恒溫磁力攪拌器(94-2ThermoFinnigan),氮吹儀(NEVAPTM111),水質化學連續(xù)流動分析儀(SEALAA3),透射電鏡(Tecnais10)。1.2方法1.2.1bg-11培養(yǎng)基的培養(yǎng)方案利用BG-11培養(yǎng)基(BG-11)將保藏的藻種在三角瓶中擴大培養(yǎng),待進入指數(shù)期后離心去除上清液,分別接入NaNO3初始濃度分別為18.0,9.0,6.0,3.6mmol/L的BG-11培養(yǎng)基中,接種的光密度(OD750)為0.6±0.01,采用Φ3.0cm×60cm的柱狀光生物反應器進行培養(yǎng),溫度為(24±1)℃,光照強度約為300μmol/(m2·s)(單側光照),24h持續(xù)光照,通氣(含1%CO2的壓縮空氣)攪拌,培養(yǎng)周期為18d,每組設置3個平行。在培養(yǎng)周期內每天定時取樣,測定生物量,繪制生長曲線。1.2.2生長條件的確定利用BG-11培養(yǎng)基(BG-11)將保藏的藻種在三角瓶中進行擴大培養(yǎng),待進入指數(shù)期后離心去除上清液,分別接入濃度為100%,75%,50%和25%的奶牛場廢水中,接種的光密度(OD750)為0.6±0.01,采用Φ3.0cm×60cm的柱狀光生物反應器進行培養(yǎng),培養(yǎng)條件同上。1.2.3藻液的干燥、抽濾、冷卻將孔徑為0.45μm的混合纖維濾膜預先于105℃的烘箱中烘干至恒重(W1),取10ml藻液用烘干的濾膜進行真空抽濾,再置于105℃的烘箱中烘干至恒重(W2),干燥器中冷卻至室溫后稱重。1.2.4總氮和總磷濃度在廢水中的測定每天定時取10mL藻液,離心后將上清液進行消解,使用水質化學連續(xù)流動分析儀測定整個培養(yǎng)周期內廢水中總氮、總磷濃度的動態(tài)變化。1.2.5抽提有機溶劑的制備將在培養(yǎng)周期最后一天所采收的藻泥凍干后,按照改進的總脂測定方法測定干藻粉的總脂含量。稱取50~100mg凍干藻粉,放置于具螺口瓶蓋體積為15mL的玻璃離心管中,再放置一小磁力棒,加入2mL二甲基亞砜-甲醇溶液(V∶V=1∶9),于磁力攪拌水浴鍋中40℃恒溫水浴1h;后冰浴抽提30min,3500r/min離心5min,轉移上清液至一小瓶中。向其余藻渣中加入4mL乙醚-正己烷(V∶V=1∶1)溶液,磁力攪拌冰浴抽提1h,3500r/min離心5min,轉移上清液至上述小瓶中,重復上述過程直至藻渣變?yōu)榛野咨Ｏ蛏鲜龊喜⒊樘嵋褐屑尤爰兯?使4種抽提有機溶液的體積比例為1∶1∶1∶1,震蕩分相,移取有機相至另一小玻璃瓶中,在通風櫥中用氮氣吹干濃縮,乙醚濃縮液轉移至事先稱重的1.5mL塑料離心管中,再用氮氣吹干至恒重。利用差量法計算干藻粉中總脂的含量。1.2.6gm-spe根據(jù)改進后的方法,用硅膠柱(AgelaTechnologoes;Cleanertsilica-SPE;500mg-SPE;500mg)將總脂進一步分離。洗脫順序:氯仿洗脫中性脂,丙酮和甲醇(V/V=9∶1)洗脫糖脂,甲醇洗脫磷脂,然后將分離的各組分用氮氣吹至較小體積后轉移至事先稱重、體積為1.5mL的塑料離心管中,再次用氮氣吹干至恒重,利用差量法計算出磷脂、糖脂及中性脂分別在總脂和干藻粉中的百分含量。1.2.7樣品溶液的制備稱取25mg凍干藻粉,放置于具螺口瓶蓋的體積為15mL的小玻璃瓶中,再放置一小磁力棒,加入2mL含有2%濃度H2SO4的無水甲醇-甲苯(V∶V=9∶1)溶液,同時加入25μL1%的十七烷酸(C17∶0),充氬氣后,將離心管放置于磁力攪拌水浴鍋中,80℃恒溫水浴1.5h;然后分別加入1mL的純水和正己烷,震蕩后以3000r/min離心5min,將上層有機相轉移至另一小玻璃瓶中,用氮氣吹干,再加入100μL正己烷密封,留存上樣。利用氣相色譜-質譜聯(lián)用(GC-MS)技術進行分析。1.2.8計算公共格式總脂單位體積含量:V=ρ×ω式中:ρ為干藻粉的生物量,g/L;ω為干藻粉的總脂含量,%;T為培養(yǎng)時間,d。2結果與討論2.1不同濃度奶牛場廢水中的生長特性圖1為在柱狀光生物反應器中,不同NaNO3初始濃度的BG-11培養(yǎng)基與不同濃度奶牛場廢水培養(yǎng)下尖狀柵藻的生長曲線。由圖1(a)可知,在BG-11培養(yǎng)組中,尖狀柵藻的生長經(jīng)歷了一個短暫的延滯期后進入指數(shù)生長期,從培養(yǎng)的第3天開始,生物量開始隨著NaNO3初始濃度的不同而有所差異,然后緩慢進入平臺期。第18天,尖狀柵藻在NaNO3初始濃度為6.0mmol/L的BG-1培養(yǎng)基中取得最高的生物量,為9.5g/L。由圖1(b)可知,尖狀柵藻在接入奶牛場廢水后并沒有出現(xiàn)短暫的延滯,說明奶牛場廢水可能適宜其生長,無需經(jīng)過短暫的適應直接進入對數(shù)生長期。在培養(yǎng)周期的前6d,尖狀柵藻在4個濃度奶牛場廢水中的生長并未有明顯的差異,說明此時4個濃度奶牛場廢水中營養(yǎng)物質含量相對尖狀柵藻的生長需求均充足;從第7天開始,4條生長曲線開始出現(xiàn)差異,且隨著奶牛場廢水初始濃度的降低,生物量有降低的趨勢;從第16天開始,尖狀柵藻的生長進入平臺期,此時100%奶牛場廢水培養(yǎng)組獲得最高的生物量,達到12.2g/L。比較兩個試驗組的生長可明顯看出,尖狀柵藻在NaNO3初始濃度為6.0mmol/L的BG-11培養(yǎng)組中取得最高的生物量9.5g/L,幾乎與25%廢水組的最高生物量相持平,而在100%廢水培養(yǎng)組獲得的最高生物量達到12.2g/L,明顯高于BG-11培養(yǎng)組。以上結果表明,尖狀柵藻對含有高濃度氮、磷的廢水具有較高的耐受性,此外,該藻能在色度大、有機物含量高的奶牛場廢水中獲得比人工培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下更高的生物量,說明在透光度較低的奶牛場廢水中該藻的代謝方式發(fā)生了轉變,由光合自養(yǎng)轉化為異養(yǎng)或混養(yǎng)的營養(yǎng)方式。2.2總氮和總磷的去除經(jīng)測定可知,原廢水中的總氮濃度為43.4mmol/L,約為BG-11培養(yǎng)基中總氮濃度(18.0mmol/L)的2.4倍。從圖2中可知,尖狀柵藻在培養(yǎng)的過程中,4個濃度廢水的總氮含量在第1天均有一個急劇的下降。25%廢水組在培養(yǎng)的第5天,總氮濃度即降至1.4mmol/L,去除率高達93.2%。50%,75%,100%廢水組中總氮含量自培養(yǎng)的第6天開始趨于一個相對穩(wěn)定的狀態(tài),其中100%廢水組在第7天時,總氮濃度降至5.9mmol/L,去除率約為86.4%。原廢水中總磷的濃度為2123.6μmol/L,約為BG-11培養(yǎng)基總磷濃度(229.9μmol/L)的9.3倍,在尖狀柵藻培養(yǎng)的過程中,4個濃度廢水的總磷含量在第1天均急劇下降,在第3天時趨于一致,均保持在13.1μmol/L,總磷的去除率達99.4%。由以上結果可知,尖狀柵藻在短期內對奶牛場廢水中總氮、總磷的去除效果明顯,是適用于奶牛場廢水處理的良好藻株。2.3初始氮濃度對尖狀柵藻總脂含量的影響微藻細胞的有機物主要由蛋白質、碳水化合物和脂質組成,圖3反映了4個不同NaNO3濃度的BG-11培養(yǎng)基與4個不同濃度廢水培養(yǎng)條件下尖狀柵藻的生化組成情況。由圖可知,尖狀柵藻的脂質含量最高,其次是碳水化合物和蛋白質。圖3(a)與圖3(b)均反映了相同的變化趨勢:隨著初始氮濃度的降低,尖狀柵藻細胞中蛋白質和碳水化合物的含量降低,總脂含量升高。圖3(a)中,NaNO3初始濃度為18.0mmol/L培養(yǎng)組藻總脂含量約占干重的49.4%,3.6mmol/L培養(yǎng)組時總脂含量約占干重的62.6%;圖3(b)中,100%的廢水組總脂含量約占干重的36.8%,25%的廢水組總脂含量約占干重的62.4%。由圖3可知,BG-11培養(yǎng)組尖狀柵藻總脂含量普遍比廢水培養(yǎng)組總脂含量高。研究表明,氮限制所構成的外界環(huán)境脅迫是一個高效促進油脂積累的方法。在兩種不同培養(yǎng)條件下,隨著培養(yǎng)時間的延續(xù),培養(yǎng)基中總氮、總磷等營養(yǎng)物質含量均降低,尤其是在初始氮濃度較低的培養(yǎng)組,氮營養(yǎng)鹽缺乏成為尖狀柵藻生長的限制因素,因此初始氮濃度最低的培養(yǎng)組中總脂含量較高。廢水中氮含量普遍比BG-11培養(yǎng)基中的高,因此廢水組尖狀柵藻總脂含量比BG-11培養(yǎng)組低。2.4廢水濃度及培養(yǎng)基組分的影響圖4總脂分級結果表明,中性脂是尖狀柵藻總脂的主要組成成分(占總脂含量的60%以上),糖脂次之,磷脂最少。隨著廢水濃度的降低,中性脂占總脂的比例升高,糖脂和磷脂降低。廢水濃度由100%~25%,總脂的含量由干重的36.8%上升至62.4%,中性脂占總脂比例由65.4%上升至87.1%。隨著廢水濃度的降低,培養(yǎng)基中氮含量也隨之降低,可能引起微藻細胞代謝途徑發(fā)生轉變,細胞中類囊體膜的含量降低,?；饷傅幕钚栽鰪姴⒋碳ち姿崴?。以上這些變化促使細胞內的脂肪酸乙酰輔-CoA含量增加,與此同時,氮含量的降低也將促進二?；视王；D移酶將脂肪酸乙酰輔-CoA轉化成三酰甘油(TAG),因此,氮含量的降低促使尖狀柵藻細胞內總脂和中性脂含量同步升高。2.5脂肪酸組成中a對廢水培養(yǎng)所得尖狀柵藻藻粉進行脂肪酸組成(圖5)分析可知,尖狀柵藻共由3種碳鏈長度的11種脂肪酸組成,其中多為不飽和脂肪酸,油酸(C18∶1)、棕櫚酸(C16∶0)所占比例較高,其次為亞麻酸(C18∶3)、亞油酸(C18∶2)和棕櫚油酸(C161)。石化柴油中的烷烴主要由15個左右碳原子組成,尖狀柵藻藻油中的脂肪酸碳鏈長度與石化柴油平均碳鏈長度相近,是生產(chǎn)生物柴油的理想原料。2.6總脂含量的測定微藻的產(chǎn)油性能不僅與微藻油脂含量相關,也與該藻生物量相關,因此,在此引入總脂單位體積含量對微藻的產(chǎn)油性能進行評價。由圖6可知,尖狀柵藻在BG-11與廢水培養(yǎng)組,單位體積藻液的總脂含量均超過4.0g/L,說明尖狀柵藻是一株極具潛力的產(chǎn)油微藻。NaNO3初始濃度為3.6mmol/L的BG-11培養(yǎng)組的尖狀柵藻總脂單位體積含量達到5.3g/L,與同類研究的數(shù)據(jù)相比優(yōu)勢明顯。在50%與25%廢水培養(yǎng)組中,該藻單位體積藻液的總脂含量分別達到5.7g/L與5.9g/L,均高于BG-11培養(yǎng)組的最高值。以上結果說明,尖狀柵藻是一株極具潛力的產(chǎn)油綠藻,且在廢水培養(yǎng)條件下其產(chǎn)油性能比在人工培養(yǎng)條件下更具優(yōu)勢。2.7總脂單位體積產(chǎn)率總脂單位體積產(chǎn)率與微藻總脂含量、生物量和培養(yǎng)時間相關