熒光定量PCR技術(shù)講座

熒光定量PCR技術(shù)講座------分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)系列講座III張志坤2010、09、10大綱一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論二、引物及Taqman探針的設(shè)計(jì)三、內(nèi)參基因的選擇四、反應(yīng)體系的優(yōu)化五、實(shí)驗(yàn)方案的選擇__六、誤差分析及操作規(guī)范七、實(shí)驗(yàn)中污染的防控八、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論1、熒光定量PCR技術(shù)概論熒光定量PCR技術(shù)產(chǎn)生并成熟于上世紀(jì)90年代，由于該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，能夠?qū)CR反應(yīng)的全過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，并且自動(dòng)化程度高，所以該技術(shù)從產(chǎn)生到現(xiàn)在短短的十幾年時(shí)間，在科研及檢驗(yàn)領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用，成為分子生物學(xué)領(lǐng)域不可或缺的一項(xiàng)重要技術(shù)。熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論1、熒光定量PCR技術(shù)概論熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)隨著PCR反應(yīng)的積累來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR反應(yīng)的進(jìn)程，并通過(guò)分析軟件對(duì)PCR的反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)分析的技術(shù)。2、熒光定量PCR常用的三個(gè)概念擴(kuò)增曲線、閾值、CT值(1)、擴(kuò)增曲線及擴(kuò)增曲線的兩種形式3論左圖反映的是隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行相應(yīng)的熒光信號(hào)的變化，比較直觀，但是指數(shù)期很短；右圖反映的是熒光信號(hào)的變化量的對(duì)數(shù)與PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)的關(guān)系，從右圖可知，指數(shù)期很明顯，在確定閾值線時(shí)具有簡(jiǎn)單明了的特點(diǎn)，所以很多軟件都采用右圖的形式，當(dāng)然了，這兩種實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要相互轉(zhuǎn)換。，、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論1cie-0031ae-DLJ42、熒光定量PCR常用的三個(gè)概念(2)、閾值線__在熒光定量PCR擴(kuò)增的指數(shù)期，畫一條線，在此直線上，所有樣品的熒光強(qiáng)度與其本底熒光強(qiáng)度的差值全部相同。106*0001=0e-0011oe-002熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論2、熒光定量PCR常用的三個(gè)概念(3)、CT值PCR過(guò)程中，各樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)，所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論3、熒光定量PCR的化學(xué)基礎(chǔ)熒光定量PCR是隨著PCR循環(huán)的進(jìn)行，以熒光信號(hào)強(qiáng)度的積累來(lái)實(shí)時(shí)反映PCR反應(yīng)進(jìn)程的。理想的熒光物質(zhì)需具備以下特占.（1）、本底低（2）、熒光強(qiáng)度高（3）、每輪PCR反應(yīng)完成后都有熒光強(qiáng)度的增高，而且這種熒光強(qiáng)度的增高和每輪循環(huán)后PCR產(chǎn)物的量成線性關(guān)系（4）、沒有PCR產(chǎn)物時(shí)，沒有熒光（5）、該熒光物質(zhì)的受激發(fā)后其發(fā)射光的波長(zhǎng)范圍窄，各種熒光不會(huì)產(chǎn)生熒光的交叉干擾熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論3、熒光定量PCR的化學(xué)基礎(chǔ)目前常用的幾種熒光物質(zhì)(1)、Taqman探針類RReporterProbeQuencher5'端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)，探針完整時(shí)，沒有熒光，探針斷裂后，在激發(fā)光的作用下，熒光基團(tuán)產(chǎn)生熒光；探針本身序列與目的基因序列互補(bǔ)，特異性高，退火后探針與目的基因互補(bǔ)序列結(jié)合，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，在Taq酶5'—3'外切酶的作用下，探針?biāo)鈹嗔?，熒光產(chǎn)生。一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論3、熒光定量PCR的化學(xué)基礎(chǔ)Taqman常用的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)熒光基團(tuán)：5’端常用熒光基團(tuán)FAM標(biāo)記，最佳激發(fā)光波長(zhǎng)：494-495nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)：518-520nmo淬滅基團(tuán)：TAMRA、BHQ、ECLIPSE等。TAMRA本身也是一種熒光基團(tuán)，激發(fā)光波長(zhǎng)范圍較寬，500—560nm，最佳激發(fā)光波長(zhǎng)在560nm附近，對(duì)FAM基團(tuán)產(chǎn)生的發(fā)射光具有較好的吸收作用；其發(fā)射光波長(zhǎng)較寬，560—650nm，當(dāng)做多重?zé)晒鈺r(shí)，容易產(chǎn)生熒光交叉干擾，并且本底較高，故現(xiàn)已不常用。BHQ和ECLIPSE為非熒光物質(zhì)，只是一種熒光淬滅劑，本身不會(huì)，、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論3、熒光定量PCR的化學(xué)基礎(chǔ)Taqman探針的特點(diǎn)及應(yīng)用（1）、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高本身具有序列特異性，保證了所檢測(cè)目的基因的特異性；其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)保證了其所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的量成正比關(guān)系，因此準(zhǔn)確性極高。（2）、對(duì)引物及試劑要求不高，配套的普通引物就可以使用，普通的Taq酶就能滿足實(shí)驗(yàn)的要求。（3）、常被用作基因含量的精確檢測(cè)（精確度可達(dá)幾十個(gè)拷貝）及基因表達(dá)變化的精確分析（精確度可達(dá)0.1倍的變化）。（4）、目前價(jià)格也不是太貴，2OD1000.00左右熒光定論HRM等。其共同性質(zhì)為：結(jié)合于雙鏈核酸的小溝處與雙鏈DNA結(jié)合后受激產(chǎn)生熒光在變性條件下雙鏈分開，熒光消失3、熒光定(2)、熒光染料類目前常用的熒光染料為SYBRGreenI、SYBRGreenllSYTO9(a)、(b)、(c)、量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理量PCR的化學(xué)基礎(chǔ)一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論3、熒光定量PCR的化學(xué)基礎(chǔ)熒光染料的特點(diǎn)及應(yīng)用(1)、能夠與所有的核酸雙鏈結(jié)合，受激后產(chǎn)生熒光，其熒光的強(qiáng)度與雙鏈核酸的含量及長(zhǎng)度成正比，因此本底較高；(2)、可做雙鏈核酸的熔解曲線分析；(3)、SYBRGreenI染料本身價(jià)格便宜，但是做熒光定量PCR時(shí)對(duì)引物設(shè)計(jì)的要求很高；對(duì)Taq酶要求較高，最好是HotStarTaq酶，或者操作時(shí)需要嚴(yán)格的冷啟動(dòng)，冰上操作，否則引物二聚體及非特異性擴(kuò)增會(huì)嚴(yán)重干擾結(jié)果的準(zhǔn)確性，尤其是模板含量較低時(shí)；(4)、適合于基因含量及基因表達(dá)變化的粗略分析或初篩；(5)、在分析的基因種類很多，但是樣品量很少時(shí)，尤其適用。(6)、對(duì)PCR反應(yīng)的毒性，能抑制PCR反應(yīng)，降低PCR反應(yīng)的效率。一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論4、熒光定量PCR的數(shù)學(xué)原理對(duì)于普通的PCR反應(yīng)來(lái)說(shuō)nXn=X0(1+E)上式中，Xn為n輪PCR循環(huán)后，目的基因PCR產(chǎn)物的量；n為PCR循環(huán)數(shù)；Xo為目的基因的初始模板量，E為PCR的反應(yīng)效率，0<E<1。，、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論4、熒光定量PCR的數(shù)學(xué)原理由于PCR反應(yīng)體系中熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的量成正比，所以用熒光強(qiáng)度來(lái)代替PCR產(chǎn)物的量，我們可以得到：nRn=Rb+Xq(1+E)Rs總熒光信號(hào)強(qiáng)度=本底信號(hào)+分子數(shù)量x單位信號(hào)強(qiáng)度Rn：第n個(gè)循環(huán)時(shí)的總信號(hào)Rb：本底R(shí)s:單位信號(hào)強(qiáng)度Xq：起始DNA數(shù)目E：PCR效率熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論4、熒光定量PCR的數(shù)學(xué)原理當(dāng)循環(huán)數(shù)n等于CT值時(shí)，所有樣品熒光信號(hào)強(qiáng)度變化量的對(duì)數(shù)全部一致，都達(dá)到了閾值。Rt=Rb+Xo(1+cE)Rslg(Rt-Rb)=lgX0+CTlg(1+E)+lgRsCTlg(1+E)=-lgXo+lg(Rt-Rb)

-lgRs此時(shí)，PCR反應(yīng)處于指數(shù)期階段，所有樣品的反應(yīng)效率E穩(wěn)定且近似相等；lg(RT-Rb)、Rs也都相同，只有CT值和-lgXo為變量，且這兩個(gè)變量之間成一次性方程。也就是說(shuō)，所有樣品的lgX0與到達(dá)閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)n(Ct值)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計(jì)算出樣品中所含的模-、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論5、熒光定量PCR線性關(guān)系成立的條件分析CTlg(1+E)=-lgXo+lg(Rt-Rb)

-lgRs(1)、PCR效率相等，在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期，E穩(wěn)定且為常數(shù)；(2)、Rt-Rb要相等；也就是說(shuō)到達(dá)閾值時(shí)樣品的熒光強(qiáng)度與樣品的熒光本底之差要相等；(3)、樣品的單位信號(hào)強(qiáng)度Rs要相等，用熒光染料做熒光基團(tuán)時(shí)，Rs就是每條PCR產(chǎn)物結(jié)合熒光染料后所發(fā)出的熒光強(qiáng)度，此熒光強(qiáng)度和PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)短有關(guān)，PCR產(chǎn)物越長(zhǎng)，結(jié)合的熒光染料越多，Rs值__越大；用探針做熒光基團(tuán)時(shí)，Rs就等于PCR反應(yīng)時(shí)，Taq酶水解左圖橫坐標(biāo)是PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)是總的熒光強(qiáng)度Rn,改圖反映的是各個(gè)樣品隨著每輪PCR反應(yīng)，其總的熒光量的實(shí)時(shí)變化；右圖橫坐標(biāo)也是PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)是總的熒光強(qiáng)度與熒光本底的差值RT-RB即ARn的對(duì)數(shù)，在右圖中確定閾值線，該直線上所有樣品的RT-RB的對(duì)數(shù)都相同，熒光定量PCR的線性關(guān)系才會(huì)成立。5、熒光定量PCR線性關(guān)系成立的條件分析3論未知樣本標(biāo)準(zhǔn)品熒光定論P(yáng)CR線性關(guān)系成立的條件分析LogXo與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過(guò)已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)未知樣品Ct值，就可以在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出未知樣品初始模板量。量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理5、熒光定量一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論6、雙鏈核酸的熔解曲線分析使用熒光染料作為熒光基團(tuán)時(shí)，由于熒光染料的特性隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，雙鏈PCR產(chǎn)物呈指數(shù)增長(zhǎng)，SYBRGreenI與雙鏈PCR產(chǎn)物結(jié)合后熒光越I'l333?3：:N#Jncr||/nani|rH：r-:JITJ?409:JUJ論IJ如下圖PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理司，其序列相同的核酸雙鏈全部打開，熒光6、雙鏈核酸的熔解曲線分析對(duì)于核酸序列相同的PCR產(chǎn)物，其TM值也相同，而且其TM值在一個(gè)很熒光定量的溫度范圍內(nèi)，在此溫度區(qū)強(qiáng)度急劇降低，以熒一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論6、雙鏈核酸的熔解曲線分析上圖就是熔解曲線，熔解曲線反映的是一定序列長(zhǎng)度的核酸雙鏈，在一定的離子強(qiáng)度下的TM值。核酸雙鏈的TM值由雙鏈核苷酸之間相連接的氫鍵決定，不同的核酸雙鏈，其TM值也不同，所以通過(guò)熔解曲線，我們能獲知雙鏈核酸的均一性、野生型和突變型雙鏈之間的堿基差異等，如果采用高分辨率熒光染料，鏈條核酸雙鏈哪怕只有一個(gè)堿基的差異，通過(guò)熔解曲線也能分析出來(lái)_一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論7、絕對(duì)定量和相對(duì)定量絕對(duì)定量相對(duì)定量f垂/繼、“600個(gè)拷貝”“增加10倍”一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論7、mRNA差異表達(dá)的相對(duì)定量分析研究基因表達(dá)的情況，我們只需搞清楚該基因在不同生理階段的變化趨勢(shì)如何就行了，而無(wú)需知道該基因的絕對(duì)量有多少。實(shí)驗(yàn)操作中，由于樣品選取時(shí)樣品的細(xì)胞個(gè)數(shù)不可能完全相同，RNA提取__時(shí)得率不同、RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度不同，這就造成了比較上的混亂，因此在進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控研究中都會(huì)用一些看內(nèi)參基因來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。常用的內(nèi)參基因是在各種生理?xiàng)l件下表達(dá)量恒定的基因，這些基因也常被稱為看家基因，該基因表達(dá)一般不隨外界的變化而變化，所以一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論7、mRNA差異表達(dá)的相對(duì)定量分析以上公式就是引入內(nèi)參基因后相對(duì)定量分析的基本公式，并由此派生出兩種相對(duì)定量的分析方法：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法和Delta-delta以法。一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論7、mRNA差異表達(dá)的相對(duì)定量分析（1）、雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法所謂的雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法就是對(duì)每個(gè)樣品的內(nèi)參基因和目的基因都做絕對(duì)定量，求出每個(gè)樣品中內(nèi)參基因和目的基因的絕對(duì)數(shù)量，然后根據(jù)相對(duì)定量的基本公式來(lái)求出目的基因的差異表達(dá)。雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法的特點(diǎn)：（a）、考慮到了不同基因擴(kuò)增效率的差異，用標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)校正擴(kuò)增效率，最大限度的避免了誤差；（b）、思路直觀、條理清晰、應(yīng)用簡(jiǎn)便，操作靈活，無(wú)需像Delta?deltaCT法那樣對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行反復(fù)的優(yōu)化；（c）、其不足之處是每次實(shí)驗(yàn)都必需對(duì)目的基因和看家基因做標(biāo)準(zhǔn)曲線；（d）、該方法適合樣品量大，但是所分析目的基因較少的實(shí)驗(yàn)。熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論該方法的前提條件是目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相同且都為1，在試驗(yàn)開始前必須分別對(duì)目的基因和內(nèi)參基因作標(biāo)準(zhǔn)曲線，看兩者擴(kuò)增效率的差別，假如兩者擴(kuò)增效率之間的差異小于0.1，就可以用該方法分析。而且在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，無(wú)需再做標(biāo)準(zhǔn)品。該方法要求嚴(yán)格的重復(fù)，因?yàn)镃T值的差異只要有很小的變化，測(cè)得的結(jié)果就會(huì)有很大的差別。該方法特別適合于樣品量不大，但是檢測(cè)的基因種類很多的情況。7、mRNA差異表達(dá)的相對(duì)定量分析（2）、2-AACT法P待檢做帥_靴鰣?bào)f-J因平均_翻平均Ct價(jià)/r對(duì)照組醐_対_番J平均Ctll_因平灼Ct值/_____二、引物及Taqman探針的設(shè)計(jì)____1、染料法引物的設(shè)計(jì)原則：____(1)、序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段，不能有堿基變異；___(2)、避免引物自身或與引物之間形成4個(gè)或4個(gè)以上連續(xù)配對(duì)，避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)；___(3)、檢測(cè)mRNA時(shí)，為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)最好能跨兩個(gè)外顯子；(4)、引物之間的TM相差避免超過(guò)2°C;(5)、典型的引物18到24個(gè)核苷長(zhǎng)；(6)、目的基因和內(nèi)參基因所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度盡量一致，不大于300bp，這樣有利于使兩種基因PCR效率相同(7)、將設(shè)計(jì)好的引物用序列分析軟件分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)并做BLAST分析其特異性二、引物及Taqman探針的設(shè)計(jì)2、Taqman探針及引物的設(shè)計(jì)原則：在Taqman探針法中，Taq酶除了5’-3’聚合酶作用之外，還要5’-3’外切酶的活性來(lái)切斷探針鏈產(chǎn)生熒光，普通PCR的延伸溫度為72°C，此溫度為Taq酶聚合作用的最佳溫度；Taqman探針法反應(yīng)中，在要求Taq酶5’-3’聚合酶活性的同時(shí)，還需要Taq酶5’-3’外切酶的活性來(lái)切斷探針鏈產(chǎn)生熒光，Taq酶5’-3’外切酶活性的最佳溫度為60C，所以TaqmanPCR反應(yīng)的一般采用兩步法，即95C變性，60C復(fù)性延伸。在Taqman探針及引物的設(shè)計(jì)過(guò)程中，引物的TM值已經(jīng)確定為60C左右，在每輪PCR循環(huán)的復(fù)性過(guò)程中（95—60C），為了確保探針先于引物二、引物及Taqman探針的設(shè)計(jì)2、Taqman探針及引物的設(shè)計(jì)原則：(1)、序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段，不能有堿基變異；(2)、檢測(cè)mRNA時(shí)，為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)最好能跨兩個(gè)外顯子；(3)、引物TM值為60°C左右，探針的TM值為70°C左右；(4)、探針的5’端應(yīng)避免使用鳥嘌呤G，因?yàn)?’G會(huì)有淬滅作用，而且即使是被切割下來(lái)還會(huì)存在淬滅作用；(5)、整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量G含量高會(huì)降低反應(yīng)效率，這時(shí)就應(yīng)選擇配對(duì)的另一條鏈作為探針；(6)、引物之間的TM相差避免超過(guò)2C；(7)、典型的引物長(zhǎng)度為18-24bp，探針長(zhǎng)度為15-45bp；(8)、PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度在50-150bp之間，這樣有利于使PCR效率相同；(9)、將設(shè)計(jì)好的引物用序列分析軟件分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)并做BLAST分析其:、引物及Taqman探針的設(shè)計(jì)H山mUTUi!in?i■*L*iHi_LJ_|dJ4■4..U.UH.!Ii

i1iii21：i-T3i■HIHI:1.200，0.B00,0.600，0.4000200-0.000Amplification?LI6fl6/19/96反義鏈：11C/3G正義鏈;3C/11G2、Taqman探針及引物的設(shè)計(jì)原則:-TT1^IT:.............4irl?i一IICEE-B.EWE?EIlu■?一EE-E-a■一____________________________________________--■-!-w---—-—-233S-IMB.**i;—-^-1nrs:?11j—J-n111^^—i——f探針中GC含量的差異對(duì)定量PCR反應(yīng)效率的影響▲、引物及Taqman探針的設(shè)計(jì)3、Taqman探針及引物的設(shè)計(jì)舉例1ATGAACTACGTTGGACAGTTAGCAGGGCAAGTGTTTGTAACTGTGAAGGAGCTCTATAAG61GGACTAAACCCAGCCACGCTGTCGGGATGTATCGATATAATTGTTGTACGTCAGCCAGAT121GGGAATCTTCAGTGTTCTCCATTCCATGTACGCTTTGGGAAAATGGGAGTTCTGCGTTCC181AGGGAGAAAGTGGTTGACATAGAAATTAATGGAGAGGCTGTAGATTTGCACATGAAGCTA241GGAGACAATGGAGAAGCCTTTTTCGTCCAGGAGATGGATAACAATCAGGAGGTAATTCCT301TATCATCTGTCTACGTCCCqlCATCCTGTCTGAGGGAACTGCGTTAATGGAAGCTCAGCTG361AAGAGAAACTCAATTGACAGGATAAGAAACCTGGACAGCAGTGTATCTTCACAAGTACCA421CCCCAAGCTCATGGATCCCAGCCTGGTACTGAAACATCTCCAGCCTGTAG經(jīng)OligCW件驗(yàn)證A探針TM值70aC左右，上下游引物的TM值都為60°C左右，二級(jí)結(jié)構(gòu)分析81引物和探絆比變理A想，A_ALA!_CTA引物和探針特異性_。八八八aAGaGaagac541ATTGGAGATACATCAGAAGATGAAGACATGTTTCCTATAGAGATTAGCTCAPAMAAPAA▲、引物及Taqman探針的設(shè)計(jì)Taqman探針及引物合成時(shí)注意事項(xiàng)、引物及探針設(shè)計(jì)好之后，委托一家放心的合成公司合成；、先不要急于合成探針，先引物合成，引物合成好以后，做普通PCR，電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，看是否和設(shè)計(jì)的長(zhǎng)度吻合，再看看非特性擴(kuò)增情況，必要時(shí)進(jìn)行PCR產(chǎn)物的測(cè)序驗(yàn)證；__、確定引物沒有問(wèn)題后，再將探針?biāo)徒缓铣桑@樣安排能避免很多外的損失；(4)、探針合成好后，先檢測(cè)一下探針的質(zhì)量，250nm的探針終濃度，25ul水，反應(yīng)體系中只有水和探針，在熒光定量PCR儀上檢測(cè)，95°C，2min;95°C，20s，60°C，20s，40個(gè)cycles；看熒光本底和熒光強(qiáng)度的變化情況，好的探針熒光本底較低，隨著PCR反應(yīng)，熒、110Z4cC>以3光強(qiáng)度不會(huì)變化，假如熒光強(qiáng)度變化的比較大，說(shuō)明探針合成質(zhì)▲、內(nèi)參基因的選擇2、常用內(nèi)參基因的表達(dá)情況⑴、GAPDHGAPDHmRNA在不同癌組織（包括肺癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌等）中的表達(dá)升高，在不同個(gè)體間、懷孕期間以及細(xì)胞周期的不同階段等變化很大，在正常的結(jié)腸上皮、人類前列腺癌的細(xì)胞周期不同階段也呈現(xiàn)出顯著性變化。在各種因素（例如低氧、胰島素、地塞米松、絲裂原、表皮生長(zhǎng)因子等）刺激下，培養(yǎng)細(xì)胞GAPDHmRNA的表達(dá)水平也不同。（2）、p-actin當(dāng)細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化時(shí)，p-actinmRNA的表達(dá)水平增加。（3）、18srRNA當(dāng)細(xì)胞有絲分裂時(shí)，18srRNA表達(dá)量顯著上調(diào)?！?、內(nèi)參基因的選擇3、內(nèi)參基因的選擇策略根據(jù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況，不同組織、不同細(xì)胞、細(xì)胞的不同生理時(shí)期、不同的理化條件刺激等，查閱相關(guān)資料，選取三、四合適的內(nèi)參基因，做熒光定量PCR，先以CT值最小的那條基因作為內(nèi)參，其他幾條內(nèi)參基因與其相比，分析所得的比值，找出比值穩(wěn)定的幾條基因，比值穩(wěn)定說(shuō)明該基因表達(dá)穩(wěn)定，適合作為理想的內(nèi)參。也可用geNorm內(nèi)參分析軟件來(lái)選擇合適的內(nèi)參基因。對(duì)于比較精確的實(shí)驗(yàn)，最好采用兩種或兩種以上表達(dá)穩(wěn)定的基因作為內(nèi)參，對(duì)每種內(nèi)參基因測(cè)得的基因表達(dá)變化求方差和平均值。http://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/index.php_都能影響Taq酶的活性進(jìn)而熒光基團(tuán)Taq酶BufferMg2+水四、反應(yīng)體系的優(yōu)化1、為什么要優(yōu)化反應(yīng)體系與普通PCR反應(yīng)相比，熒光定量PCR在反應(yīng)中加入了熒光物質(zhì)，用以實(shí)時(shí)顯示反應(yīng)的進(jìn)程，Taqman探針法在普通PCR反應(yīng)體系中加入了與擴(kuò)增片段互補(bǔ)的一段帶熒光標(biāo)記的核酸序列，Taq酶除了5’_3’聚合酶作用之外，還要發(fā)揮5'-3'外切酶的活性來(lái)水解探針鏈來(lái)產(chǎn)生熒光；SybrGreen法加入普通PCR反應(yīng)體系能與》影響PCRBU反應(yīng)效率Mg2+水定量PCR反應(yīng)體系引鏈核酸結(jié)合的熒光染料，這些熒光Taq酶四、反應(yīng)體系的優(yōu)化1、為什么要優(yōu)化反應(yīng)體系普通PCR結(jié)果電泳圖添加熒光基團(tuán)后PCR結(jié)果電泳圖四、反應(yīng)體系的優(yōu)化2、如何優(yōu)化由上圖可知，添加熒光基團(tuán)后，PCR的反應(yīng)效率幾乎為0，所以必須對(duì)熒光定量PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)體系中各個(gè)反應(yīng)成分的濃度進(jìn)行調(diào)整。其中最關(guān)鍵的因素：Mg2+濃度、熒光基團(tuán)濃度、引物濃度對(duì)于SYBRGreenI熒光染料定量PCR反應(yīng)體系來(lái)說(shuō)，Mg2+的最佳濃度為3.0-4.0mM；對(duì)于Taqman探針反應(yīng)體系來(lái)說(shuō)，Mg2+的最佳濃度為5.0mM左右，引物最佳濃度為500nM，探針的最佳濃度為250nM。SYBRGreenI反應(yīng)體系中Mg2+濃度梯度優(yōu)化PCR電泳結(jié)果四、反應(yīng)體系的優(yōu)化2、如何優(yōu)化優(yōu)化后的Taqman探針體系實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Mg2+濃度為5.0mM左右，引物濃度為500nM，探針濃度為250nMo四、反應(yīng)體系的優(yōu)化3、自行配制熒光定量PCR試劑(1)、常用的SYBRGreenI預(yù)混酶(2X)HotStarTaqE+Buffer+Mg2其中Mg2+濃度為6?7mM(2)、常用的Taqman預(yù)混酶(2X)TaqE+Buffer+Mg2其中Mg2+濃度為10mM五、實(shí)驗(yàn)方案的選擇定量PCR實(shí)驗(yàn)方案「雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法.熒光染料法、L2-AACT法定量PCR實(shí)驗(yàn)方案＜f雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法-Taqman探針法乂

2-AACT法_______________________五、實(shí)驗(yàn)方案的選擇________定量PCR實(shí)驗(yàn)方案（1）、染料法適合于基因含量及基因表達(dá)變化的粗略分析或初篩；在分析__的基因種類很多，但是樣品量很少時(shí)，尤其適用。（2）、探針法適合常被用作基因含量的精確檢測(cè)（精確度可達(dá)幾十個(gè)拷貝）___及基因表達(dá)變化的精確分析（精確度可達(dá)0.1倍的變化）。_________（3）、雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法適合樣品量大、檢測(cè)的基因種類相對(duì)較少、精度要求__較高的實(shí)驗(yàn)。（4）、2-AACT法適合檢測(cè)精度要求一般，樣品量相對(duì)較少，檢測(cè)的基___因種類相對(duì)較多的實(shí)驗(yàn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況，如檢測(cè)的精度要求樣品數(shù)量基因數(shù)量六、誤差分析及操作規(guī)范1、誤差分析（1）、實(shí)驗(yàn)方案本身的誤差熒光染料法由于染料本身的特性，不可避免的會(huì)引起誤差；2-AACT法由于也是一種近似的算法，所以不可避免的也會(huì)引起誤差；Taqman探針法誤差相對(duì)較??；雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法誤差相對(duì)較小。（2）、儀器設(shè)備引起的誤差測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)品核酸濃度時(shí)，分光光度計(jì)的誤差，從光密度值到質(zhì)量再到摩爾量，誤差本身就很大（雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法不一定非要測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度）；定量PCR儀的誤差六、誤差分析及操作規(guī)范1、誤差分析(3)、相對(duì)定量時(shí)內(nèi)參基因表達(dá)不穩(wěn)定引起的誤差(4)、操作引起的誤差樣品處理、選取、核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、加樣，操作過(guò)程中引起的誤差。2、操作規(guī)范熒光定量PCR是一項(xiàng)對(duì)操作要求很高的實(shí)驗(yàn)，同時(shí)又是花費(fèi)很高的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，這就要求必須最大程度的減少誤差或避免錯(cuò)誤。要想達(dá)到這個(gè)目標(biāo)，我們必須從樣品的選取開始到上樣檢測(cè)，每一步都要規(guī)范操作。(1)、樣品的處理及選取處理樣品時(shí)，必須確保樣品都得到了充分的處理。如測(cè)定一種藥物到小白鼠免疫系統(tǒng)的影響，必須做到每次飼喂時(shí)此藥品完全被小白鼠攝食；選取試驗(yàn)樣品時(shí)，要保證選取的組織盡可能的純，不要六、誤差分析及操作規(guī)范2、操作規(guī)范(2)、核酸提取加入液氮研磨要徹底，蛋白、多糖、多酚類物質(zhì)要去除干凈，確保得到高質(zhì)量的核酸，分光光度計(jì)檢測(cè)核算質(zhì)量，RNA0D260/280=2.0左右，DNA0D260/280=1.8左右，最好再做電泳檢測(cè)；同一樣品要提取2到3個(gè)RNA，所剩余的樣品不要丟棄，繼續(xù)低溫保存。(3)、得到的RNA立即反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RNA樣品最好不要存放，反轉(zhuǎn)錄所得cDNA要用看家基因檢測(cè)。(4)、對(duì)于精度要求較高的定量PCR，最好先在樣品的所有組織類型內(nèi)做內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析，找出表達(dá)恒定基因作為內(nèi)參。(5)、做定量PCR時(shí)，先把除模板外的所有試劑預(yù)混，然后分裝到PCR管中，分裝時(shí)盡量采用排槍，加樣時(shí)盡量最好采用排槍。之7?■!■>曰、n八卜士h、r/

人、『/工口絕工n小單AA/白絕_六、誤差分析及操作規(guī)范2、操作規(guī)范⑺、重復(fù)操作讓重復(fù)操作最大的修正偏差？最有意義的重復(fù)是在提取樣品RNA時(shí)就重復(fù)，同一個(gè)樣品，分別提取3份RNA，3份RNA都做反轉(zhuǎn)錄，所得的3份cDNA都做定量PCR檢測(cè)，這樣的重復(fù)之所以最有意義是因?yàn)槲覀兪前裄NA提取、反轉(zhuǎn)錄、上機(jī)檢測(cè)三步做了重復(fù)，這樣得出的平均值要比只在上機(jī)檢測(cè)時(shí)對(duì)同一cDNA樣品做三個(gè)重復(fù)要有意義的多。同一個(gè)cDNA樣品做三個(gè)重復(fù)定量檢測(cè)求平均值主要是消除加樣時(shí)的誤差，排槍加樣時(shí)，誤差很小，加樣時(shí)的誤差可以通過(guò)設(shè)幾個(gè)重復(fù)檢測(cè)出來(lái)。六、誤差分析及操作規(guī)范1.0e*0011.06*0001oe-ooi1.0e-0021.0e-003I0e-00410e-0052、操作規(guī)范UCE同一cDNA樣品的三個(gè)重復(fù)42.04532.U4Lr；??|'I4R:12呵2.045557560806670Tempei抽ure(*C)1224G7E911131517T9212225^72931Cycle-xMeltin■P■ak^23253739六、誤差分析及操作規(guī)范模板濃度越低，染料法的誤差越大。如圖一系列梯度稀釋的模板，理論上它們?cè)跀U(kuò)增曲線上的CT值之差，應(yīng)該相等，但是后邊幾個(gè)濃度低的樣品CT值明顯提前了，由熔解曲線可知對(duì)于濃度低的樣品，引物二聚體引起的誤差非常嚴(yán)重。七、實(shí)驗(yàn)中污染的防控1、熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中污染源的分析（1）、PCR產(chǎn)物引起的污染在檢測(cè)過(guò)程中，熒光定量PCR產(chǎn)物都是封閉在PCR管中的，不存在開管檢測(cè)，所以有污染的話，最有可能是因?yàn)殡娪緳z測(cè)熒光定量PCR產(chǎn)物時(shí)引起的污染，只要將電泳室與PCR加樣室隔離開，就能有效的避免PCR產(chǎn)物的污染。（2）、標(biāo)準(zhǔn)品引起的污染常用的標(biāo)準(zhǔn)品有含有目的基因的質(zhì)粒、純化后的PCR產(chǎn)物等，由于標(biāo)準(zhǔn)品的濃度是一系列從高到低梯度稀釋的，所以在稀釋過(guò)程中，有可能引起污染。（3）、高濃度的樣品引起的污染房(2)樣操(3)能七、買驗(yàn)中污染的防控?zé)晒舛縋CR實(shí)驗(yàn)中污染的防控、對(duì)于PCR產(chǎn)物引起的污染最簡(jiǎn)單有效地辦法就是將電泳室與加樣室徹底隔離開，做到每個(gè)間都有專屬的移液器，做到移液器專用；或者采用dU代替dT配合UNG酶，是解決PCR產(chǎn)物污染的有效辦法，但是成本較高。、對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品引起的污染目前只能是以預(yù)防，加標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)最好采用專用移液器，不要和加的移液器交叉使用，加標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)最好在通風(fēng)廚中進(jìn)行，和加樣的作臺(tái)隔離開。、對(duì)于樣品間的檢查污染樣品間的交叉污染往往是因?yàn)楦邼舛鹊臉悠吩诩訕邮倚纬闪藲馊苣z，因?yàn)闃悠返腸DNA鏈較長(zhǎng)，經(jīng)常開紫外燈，把長(zhǎng)鏈cDNA打斷，r1有效避免此類污染的發(fā)生，另外保持加樣室空氣流通也有助于防七、實(shí)驗(yàn)中污染的防控2、熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中污染的防控(4)、對(duì)于未知污染源的頑固的污染的防控這類污染也經(jīng)常出現(xiàn)，找不到明確的污染源，而且此類污染又非常頑固，對(duì)于這種情況，最好的辦法就是不去管它，在采用絕對(duì)定量和雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法時(shí)，污染的初始模板量可由陰性對(duì)照檢測(cè)出來(lái)，知道了污染的初始模板量后，我們可以把測(cè)得樣品的初始模板量減去污染的初始模板量，在分析時(shí)就避免了污染造成的誤差。4污染的防控七、實(shí)驗(yàn)圖中最后一個(gè)樣品為陰性對(duì)照，本來(lái)應(yīng)該是一直線，但是儀器也檢測(cè)到了熒光信號(hào)Rn朽Cycle1030.930830J30630.530430.331234567B9101112131415W171819202122232425262728293031323334353637303940CycleNumber七、實(shí)驗(yàn)中污染的防控電泳結(jié)果顯示，該陰性對(duì)照確實(shí)有PCR產(chǎn)物