淺談過氧化氫蒸汽滅菌與驗證的相關(guān)問題

淺談過氧化氫蒸汽滅菌與驗證的相關(guān)問題近年來,過氧化氫蒸汽滅菌技術(shù)越來越受無菌制藥界的重視.但是,統(tǒng)觀國內(nèi)絕大多數(shù)的過氧化氫蒸汽滅菌技術(shù)應(yīng)用案例,不難發(fā)現(xiàn)眾多過氧化氫蒸汽滅菌技術(shù)開發(fā)商或者使用者對過氧化氫滅菌技術(shù)及過氧化氫的滅菌驗證的認(rèn)識存在一定的誤區(qū).本文將對過氧化氫蒸汽滅菌及驗證所面對的相關(guān)問題進(jìn)行探討.近年來，過氧化氫蒸汽滅菌技術(shù)越來越受無菌制藥界的重視。但是，統(tǒng)觀國內(nèi)絕大多數(shù)的過氧化氫蒸汽滅菌技術(shù)應(yīng)用案例，不難發(fā)現(xiàn)眾多過氧化氫蒸汽滅菌技術(shù)開發(fā)商或者使用者對過氧化氫滅菌技術(shù)及過氧化氫的滅菌驗證的認(rèn)識存在一定的誤區(qū)。本文將對過氧化氫蒸汽滅菌及驗證所面對的相關(guān)問題進(jìn)行探討。過氧化氫是一種具有高消毒能力、無毒副殘留的消毒劑，常被用來對具有潛在生物危害的場所或空間進(jìn)行消毒或滅菌。近年來，過氧化氫蒸汽滅菌技術(shù)越來越受制藥界的重視，因此市面上涌現(xiàn)了大量的過氧化氫蒸汽發(fā)生裝置，有稱為“干”式的，有稱為“濕”式的，還有稱為“真空”式的，甚至還有稱為“干霧”式的等等。面對如此眾多的過氧化氫滅菌新設(shè)備和新工藝，如何科學(xué)全面地驗證過氧化氫的滅菌是當(dāng)前過氧化氫滅菌技術(shù)應(yīng)用的一個棘手問題。統(tǒng)觀國內(nèi)絕大多數(shù)的過氧化氫蒸汽滅菌技術(shù)應(yīng)用案例，諸如滅菌要求不明確、驗證程序不規(guī)范及常規(guī)監(jiān)測不重視等問題是屢見不鮮，本文將對過氧化氫蒸汽滅菌及驗證所面對的相關(guān)問題進(jìn)行探討。過氧化氫滅菌驗證的問題過氧化氫滅菌效果的要求滅菌是指殺滅細(xì)菌及其細(xì)菌繁殖體、芽孢、病毒和真菌孢子等一切形式的微生物的過程。它是不能由隨后的產(chǎn)品檢驗和試驗來充分證實其結(jié)果的特殊過程[1]。國際上，為了量化“無菌”的標(biāo)準(zhǔn)，提出“無菌保證水平”的概念，并以此來評價滅菌的殺滅效果。我國及歐美藥典都將無菌保證水平值不大于百萬分之一作為最終滅菌產(chǎn)品的無菌保證要求。關(guān)于過氧化氫蒸汽滅菌的滅菌效果的要求，國內(nèi)外對此一直爭論不休。通常而言，國際上將過氧化氫蒸汽的凈化處理過程視為“除染”，而不是“滅菌”。因此，要求過氧化氫蒸汽的滅菌效果達(dá)到最終滅菌產(chǎn)品的滅菌要求似乎是不太明智的。正是如此，不難發(fā)現(xiàn)在國際權(quán)威的相關(guān)法規(guī)和指南上，如表1所示，過氧化氫滅菌效果的要求不是要求該工藝的無菌保證水平值低于SAL（10-6），而相替代的是達(dá)到孢子對數(shù)降值為6SLR是足夠的。就應(yīng)用過氧化氫蒸汽滅菌技術(shù)于隔離器或其他設(shè)備的而言，“美國注射藥物協(xié)會”（PDA）第34號技術(shù)報告提到：“不與藥品直接接觸的部件或設(shè)備的滅菌要求與直接和藥品相接觸的部件或設(shè)備的滅菌要求是不相同的。通過完全殺滅具有較強(qiáng)抗性的孢子量為103的生物指示劑（相當(dāng)于殺死5-log或更高的滅菌水平），能足夠保證隔離器內(nèi)部沒有可檢測的微生物”[2]。而“美國食品及藥物管理局”（FDA）則推薦到，應(yīng)用過氧化氫蒸汽對無菌制藥領(lǐng)域的隔離器進(jìn)行滅菌，其滅菌能力達(dá)到4~6log是比較合適的[3]。就過氧化氫滅菌水平要求而言，作者認(rèn)為除了考慮無菌保證水平外，還應(yīng)考慮實際應(yīng)用條件、人員安全、環(huán)境破壞及滅菌驗證方法等條件。目前，過氧化氫蒸汽滅菌應(yīng)用的場合有潔凈室、實驗室、疾控中心、航天飛機(jī)艙、救護(hù)車、傳遞窗、隔離器、生物安全柜等區(qū)域，而這些區(qū)域的內(nèi)部表面并未與藥品或產(chǎn)品直接接觸。而在應(yīng)用過氧化氫蒸汽對這些區(qū)域進(jìn)行滅菌的驗證過程中，要求該滅菌工藝的非無菌單元概率值（PNSU）低于千分之一是可以接受的。但是，僅要求過氧化氫蒸汽滅菌處理的效果致使挑戰(zhàn)生物指示物的孢子對數(shù)降值為6SLR是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。對于不同滅菌場合或滅菌區(qū)域而言，初始生物負(fù)載水平參差不齊。而且，也難以保持初始生物負(fù)載水平穩(wěn)定。因此，就特定區(qū)域進(jìn)行過氧化氫蒸汽滅菌的滅菌驗證而言，如果初始生物負(fù)載的數(shù)量及抗性超出預(yù)期，那么，最終的非無菌單元概率值（PNSU）是遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于無菌保證水平值的。生物指示劑就挑戰(zhàn)微生物而言，2010版中國藥典[4]提到，過氧化氫蒸汽的滅菌驗證的生物指示劑的挑戰(zhàn)微生物常選擇嗜熱脂肪芽胞桿菌的孢子。不僅是因為該類微生物對過氧化氫蒸汽顯示相當(dāng)強(qiáng)的抗性，而且還因該類微生物可有效地減少交叉污染的風(fēng)險（培養(yǎng)溫度在55~60℃）。正是如此，市面上的用于過氧化氫滅菌驗證的生物指示劑大多數(shù)都選擇該細(xì)菌孢子作為標(biāo)準(zhǔn)挑戰(zhàn)微生物。目前，就挑戰(zhàn)所選擇的生物指示劑的孢子量的問題，國內(nèi)外尚有很多爭議。作者認(rèn)為在微生物致死過程遵循一級動力學(xué)的前提下（換言之，過氧化氫的滅菌致死性與挑戰(zhàn)微生物數(shù)目無關(guān)），過氧化氫滅菌效果的確定與孢子量之間沒有必然的聯(lián)系。過氧化氫蒸汽滅菌工藝的滅菌能力是由“滅菌驗證方法”所決定的。因此，而為了達(dá)到6SLR的滅菌要求，沒有必要選擇孢子量為10^6的生物指示劑進(jìn)行驗證。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，在同等過氧化氫滅菌條件作用下，相比具有同種孢子但孢子量較低的生物指示劑，較高孢子量的生物指示劑的抗性要高一些[13]。因此，如果選擇較高孢子量的生物指示劑進(jìn)行滅菌工藝開發(fā)所獲得的滅菌循環(huán)是相對“保守”且“過度”的。市面上適用于過氧化氫蒸汽滅菌驗證和監(jiān)測的生物指示劑多種多樣，它們的主要不同之處在于其基底載體的差異。有的是用紙條做載體、有的是玻璃纖維，有的是不銹鋼片等等。一些學(xué)者認(rèn)為，鑒于過氧化氫所滅菌區(qū)域的表面材質(zhì)差異，因此應(yīng)選擇目標(biāo)滅菌區(qū)域最具抗性的材質(zhì)作為挑戰(zhàn)指示劑的基底材質(zhì)。盡管在不同基底材質(zhì)上的生物指示物的抗性有所差異。但是，事實證明，以所謂的“最差”基底材質(zhì)進(jìn)行滅菌工藝開發(fā)所獲得的滅菌效力與以其他基底材質(zhì)所獲得的結(jié)果沒有多大的差異。而真正問題的實質(zhì)在于生物指示劑上的孢子相對于在生物負(fù)載的抗性差異。無容置疑，生物指示劑供應(yīng)商應(yīng)提供該指示劑的相應(yīng)的菌種數(shù)目穩(wěn)定性及抗性數(shù)據(jù)（D值）。如圖1所示，為1999~2005年間Apex實驗室公司所生產(chǎn)的生物指示劑的標(biāo)簽上標(biāo)注的D值與實際應(yīng)用所測量的D值的對比圖[5]。由此可知，生物指示劑供應(yīng)商所提供的D值數(shù)據(jù)與實際復(fù)核測試所得結(jié)果有很大的出入。就指示劑的抗性復(fù)核測試而言，即使在生物指示劑供應(yīng)商同樣的滅菌條件下進(jìn)行抗性測試，但由于與供應(yīng)商測定的方法的不同或者過氧化氫滅菌設(shè)備的差異，最終測試所獲得的抗性結(jié)果可能與指示劑供應(yīng)商所提供的D值仍有所差異。那么對生物指示劑的抗性數(shù)據(jù)進(jìn)行測試的意義何在？作者認(rèn)為，對每批的生物指示劑進(jìn)行抗性測試和孢子計數(shù)是比較嚴(yán)謹(jǐn)?shù)淖龇?，通過此測試可追溯并評價不同批次的生物指示劑的抗性差異，并為再驗證的滅菌能力的評估提供參考。挑戰(zhàn)位點就過氧化氫蒸汽滅菌驗證而言，滅菌的最不利位點的確定是滅菌工藝開發(fā)和滅菌驗證的關(guān)鍵所在。然而，在目前可獲得的方法中，很難科學(xué)直觀的確立過氧化氫滅菌的最不利條件和位置。正是如此，在過氧化氫氣體較難擴(kuò)散的位置處放置足夠多的生物指示劑以進(jìn)行滅菌挑戰(zhàn)也是無奈之舉。近年來，有不少案例報道了通過物理參數(shù)實時評估（諸如溫度分布、濕度分布、煙霧測試及濃度分布）及“計算機(jī)工程模擬技術(shù)”（CFD）對過氧化氫蒸汽滅菌的最不利位點進(jìn)行研究。但是，其高昂的成本，復(fù)雜的數(shù)據(jù)分析讓眾多熱衷于過氧化氫滅菌應(yīng)用的終端使用者望而生畏。因此，通過分布較多的生物指示劑和化學(xué)指示劑進(jìn)行工藝挑戰(zhàn)以確定滅菌不利位點和滅菌致死率是比較主流的驗證方法。就生物指示劑挑戰(zhàn)位點的數(shù)目而言：PDA第34號技術(shù)報告中提到，在隔離器腔體內(nèi)部空間內(nèi)，每平方米放置5~10個的生物指示劑是足夠的。為了確認(rèn)滅菌劑是否充分分布整個腔體，生物指示劑需充分分散放置在隔離器的表面上[2]。JamesAgalloco和JamesAkers[6]提到，就大型系統(tǒng)設(shè)備或區(qū)域而言（大于4m3），至少需要30個生物指示劑放置位點以進(jìn)行滅菌驗證，而就較小的體積的滅菌區(qū)域而言（小于1m3），10~15個生物指示劑驗證位點是比較合適的，而體積大小介于兩者的情況，25~30個生物指示劑是足夠的。滅菌工藝開發(fā)幾乎所有的過氧化氫滅菌設(shè)備或系統(tǒng)的供應(yīng)商都可提供相應(yīng)的滅菌工藝開發(fā)的輔助服務(wù)。然而，在國內(nèi)眾多的過氧化氫滅菌應(yīng)用案例中，“滅菌工藝開發(fā)”過程常被忽略并以所謂的“內(nèi)部經(jīng)驗”取而代之。不管選擇何種滅菌劑或滅菌設(shè)備，以科學(xué)的測試方法評估和規(guī)范日常滅菌操作程序，并以此最終確立穩(wěn)健的日常滅菌參數(shù)的過程是非常必要的。而滅菌工藝開發(fā)正是該規(guī)范化過程，目前，傳統(tǒng)的主流滅菌工藝開發(fā)流程如下：a.初始生物負(fù)載評估與分析：確立滅菌目標(biāo)；b.溫度分布、氣流分析、關(guān)鍵區(qū)域評估等：確立滅菌不利位點；c.化學(xué)指示劑分布、濃度分布、氣流模擬等：確立氣流分布特征；d.參數(shù)設(shè)置與D值測試：確立滅菌致死率和滅菌參數(shù)；e.參數(shù)優(yōu)化與確認(rèn)：滅菌挑戰(zhàn)與性能確認(rèn)；f.通風(fēng)與殘留：安全評估；許多學(xué)者主張使用“陰性分?jǐn)?shù)法”以確定過氧化氫滅菌循環(huán)的滅菌致死率。執(zhí)行陰性分?jǐn)?shù)法的前提是保證滅菌工藝穩(wěn)定，并且要求關(guān)鍵滅菌作用條件恒定。然而，對于現(xiàn)行的過氧化氫蒸汽滅菌工藝而言，在滅菌過程中，控制過氧化氫的氣液平衡是非常困難的。因為，在滅菌過程中，溫度，相對濕度、過氧化氫氣體濃度、壓力及過氧化氫凝結(jié)等都是不斷變化的。正是如此，F(xiàn)DA并不十分支持此類通過測定D值以確立滅菌致死性能的做法。但是，而使用類似于在環(huán)氧乙烷滅菌驗證中所用的“半周期法”以建立的過氧化氫滅菌循環(huán)時間的提議更是非常不可取的。因為通過此法所確立的滅菌循環(huán)的滅菌循環(huán)周期非常長。此外，由此方法所產(chǎn)生的安全和經(jīng)濟(jì)問題也是不可預(yù)知的。雖然，嚴(yán)格控制過氧化氫關(guān)鍵滅菌變量在恒定的水平是不太現(xiàn)實的。但是，在相同的滅菌設(shè)備和滅菌區(qū)域、相同的滅菌環(huán)境及相同的滅菌參數(shù)條件下，獲得一致的“滅菌作用模式”不是不可能的?，F(xiàn)行的報告或文章提到，過氧化氫蒸汽滅菌過程是一個受多參數(shù)影響的物理及化學(xué)綜合作用過程，其滅菌效力主要受過氧化氫濃度、溫度、相對濕度、表面的過氧化氫的凝結(jié)量影響[7]。因此，可通過控制過氧化氫蒸汽滅菌過程的氣流參數(shù)以獲得相對一致的“滅菌作用模式”。盡管滅菌環(huán)境條件（溫濕度）本身控制難度大，但是國際相關(guān)學(xué)者及相關(guān)論著提到環(huán)境條件本身對VPHP工藝的影響不是很大。Unger[8]等人較早對影響過氧化氫的殺孢子能力的滅菌條件進(jìn)行研究，結(jié)果表明，汽態(tài)過氧化氫對微生物滅活的主要因素是在滅菌過程中在微生物表面所分布的水和過氧化氫分子，而氣體中的過氧化氫濃度并不起關(guān)鍵性作用。為了克服因滅菌工藝波動或者設(shè)備變數(shù)所造成的滅菌性能差異，許多學(xué)者建議在滅菌工藝開發(fā)所得到的滅菌暴露時間基礎(chǔ)上增加20%。據(jù)2001年ISPE所統(tǒng)計，在應(yīng)用過氧化氫蒸汽對隔離器進(jìn)行滅菌的483個案例中，通過使用孢子量為10^6的生物指示劑所驗證的滅菌工藝都是合格的[9]?！霸衮炞C”的注意事項滅菌是保證無菌作業(yè)設(shè)備或系統(tǒng)的無菌性能的一個重要步驟，可通過使用生物指示劑對滅菌效果的再確認(rèn)。如果在再驗證過程中所使用的生物指示劑的抗性比“前驗證”的生物指示劑抗性高，盡管滅菌工藝并沒有改變，然而仍有可能會得到非預(yù)期的滅菌失敗的結(jié)果。因此，在進(jìn)行再驗證之前，對挑戰(zhàn)測試的生物指示劑的抗性進(jìn)行測試和評估，并因此對滅菌的預(yù)期目標(biāo)（期望）進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整，然后再執(zhí)行再驗證是比較科學(xué)的做法。過氧化氫滅菌應(yīng)用的相關(guān)問題材料兼容性與腐蝕作為一種強(qiáng)化學(xué)作用的化學(xué)物品，過氧化氫的腐蝕性一直是一個“老生常談”的問題。除尼龍、碳鋼、環(huán)氧樹脂彩鋼板、塑鋼以及部分橡膠（乳膠橡膠、丁腈橡膠、氯丁橡膠等）等材料外，過氧化氫蒸汽可與大多數(shù)材料良好兼容。在某些特定條件下，過氧化氫凝結(jié)的多少和作用時間的長短影響著滅菌的效果。但是，高濃度的過氧化氫凝結(jié)及作用時間關(guān)聯(lián)著滅菌表面材質(zhì)的腐蝕問題。故在滅菌工藝的開發(fā)過程中，需要權(quán)衡和協(xié)調(diào)凝結(jié)量（時間）與滅菌效果的平衡。而采用過度殺滅法所確立的滅菌循環(huán)的作用時間和劑量都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出實際所需，正是如此，因過度滅菌所給材質(zhì)帶來的腐蝕或者影響是大大增加的。殘留與安全許多過氧化氫滅菌系統(tǒng)的使用者都比較擔(dān)心過氧化氫的殘留對人、工藝、產(chǎn)品及使用設(shè)備的影響，因此要求對過氧化氫滅菌殘留進(jìn)行驗證。作者認(rèn)為，對于遺留在與藥品直接接觸的材料的滅菌劑殘留而言，殘留水平是必需鑒定的。然而，就不與藥品直接接觸的表面進(jìn)行凈化處理而言，一定限度的過氧化氫殘留并非會對依賴于產(chǎn)品特性的“無菌作業(yè)”產(chǎn)生多大的影響。因此，不必“過分糾結(jié)”遺留在不與藥品直接接觸的材料上過氧化氫殘留。就職業(yè)危害和人員安全而言，現(xiàn)行的美國職業(yè)安全及健康管理署對過氧化氫的“允許暴露濃度值”要求為8h“加權(quán)平均值”低于1ppm（或表述為1.4mg/m3）。與此類似，美國國家職業(yè)安全與健康研究所推薦過氧化氫的“暴露濃度值”要求為10h（40h/周）“加權(quán)平均值”低于1ppm。此外，就污染安全排放標(biāo)準(zhǔn)而言，美國國家工業(yè)衛(wèi)生學(xué)家會對過氧化氫的“污染排放臨界值”定義為1ppm。對于那些殘留滅菌劑會阻礙微生物生長的使用環(huán)境，上述的殘留限度要求是比較合適的。國際上一些知名藥企也對過氧化氫的殘留問題進(jìn)行了較為細(xì)致的研究，他們所使用的檢測儀器可以對極低濃度的過氧化氫進(jìn)行檢測。然而，就僅進(jìn)行無菌作業(yè)及過氧化氫工藝本身不與人員直接接觸（被隔離器屏蔽）的環(huán)境而言，過氧化氫氣體的殘留限度值低于5ppm是可以接受的。因為在僅進(jìn)行不與無菌注射藥品直接相接觸的無菌作業(yè)的環(huán)境下，該限度水平下的的殘留不會對產(chǎn)品產(chǎn)生影響，而且在8h的通風(fēng)過程中，過氧化氫殘留量是隨時間逐漸下降的。滅菌區(qū)域內(nèi)表面的結(jié)構(gòu)材質(zhì)可能是導(dǎo)致通風(fēng)時間較長的罪魁禍?zhǔn)住ＶT如PVC、Perspex、聚乙烯等材質(zhì)可吸收過氧化氫，從而致使通風(fēng)過程非常緩慢。在某種程度上而言，通過增加風(fēng)量和換氣次數(shù)的做法對通風(fēng)排殘效率的提高有一定的作用。但是對吸附有過氧化氫的材質(zhì)而言，脫氣和排殘效果有限。因此，限制過氧化氫滅菌的作用時間可以減少此類材質(zhì)對過氧化氫的吸收，從而提高滅菌效率并減少滅菌劑殘留。無菌維持與滅菌間隔在使用過氧化氫蒸汽對待滅菌區(qū)域進(jìn)行“除染”處理后，使用諸如環(huán)境壓差控制或其他環(huán)境控制技術(shù)對該凈化環(huán)境進(jìn)行無菌維護(hù)是非常必要的。其中需要注意的是“除染”與“滅菌”有所差異，經(jīng)除染處理的滅菌表面并非與藥品直接接觸（不用注射到病人體內(nèi)）。因此，過度要求經(jīng)過氧化氫蒸汽滅菌處理后的所有滅菌區(qū)域達(dá)到無菌要求是沒有任何意義的。如何確定不同滅菌批次間的滅菌間隔是當(dāng)前過氧化氫滅菌應(yīng)用的另一個重要的問題。滅菌間隔的時長與滅菌區(qū)域內(nèi)的日常活動、無菌維持及環(huán)境控制等因素有關(guān)。眾所周知，應(yīng)用于無菌制藥工業(yè)的灌裝隔離器的無菌要求是比較重要的，下面就該隔離器的無菌維持和滅菌間隔的時間確定方法進(jìn)行舉例說明。傳統(tǒng)做法是通過在預(yù)期的生產(chǎn)活動期間內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)基模擬灌裝，以該不同時間段灌裝的培養(yǎng)基的培養(yǎng)結(jié)果以確定日常滅菌的間隔時長。該方法是對整個無菌制藥系統(tǒng)的無菌保證的綜合性測試結(jié)果。大量事實證明，通過培養(yǎng)基灌裝檢測出無菌環(huán)境出現(xiàn)陽性染菌結(jié)果的概率要比隔離器環(huán)境監(jiān)測測試所獲得的染菌概率低得多。因此，傳統(tǒng)的培養(yǎng)基灌裝以確定的滅菌間隔是有風(fēng)險的。而通過諸如持續(xù)的正壓維持、在線的粒子監(jiān)測及日常微生物評估等方法以對無菌環(huán)境進(jìn)行維持，在此基礎(chǔ)上確立的滅菌間隔是比較穩(wěn)妥的做法。小結(jié)目前，有多種滅菌方法可選擇以除去各種物品表面的“生化污染”。過氧化氫蒸汽滅菌技術(shù)作為一種新興滅菌技術(shù)，其本身特有的無毒副殘留、快速、易于驗證、可靠安全等優(yōu)點越來越被國內(nèi)外制藥界及生物技術(shù)領(lǐng)域的普遍青睞。無論是設(shè)備供應(yīng)商，還是終端的使用者，他們面臨的最大的問題不是如何正確理解過氧化氫的滅菌機(jī)制和原理，而是如何科學(xué)地應(yīng)用和驗證該新興的滅菌工藝。在當(dāng)前國內(nèi)市場日益增高的質(zhì)量訴求下，規(guī)范的滅菌工藝、科學(xué)的驗證手段成為制藥界乃至生物醫(yī)療領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急。不管采用何種過氧化氫滅菌工藝，不能簡單地認(rèn)為達(dá)到預(yù)定的滅菌目標(biāo)就判定滅菌工藝驗證合格。只有配合使用物理或化學(xué)監(jiān)測手段，通過合理的滅菌周期開發(fā)和確定以獲得預(yù)期所需的物理、化學(xué)及微生物結(jié)果時，才能判定過氧化氫滅菌工藝的合格?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】[1]ISO11135-1Sterilizationofhealthcareproducts---Ethyleneoxide---Part1:Requirementsfordevelopment,validationandroutinecontrolofasterilizationprocessformedicaldevices.

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