DNA-RAN-瓊脂糖凝膠電泳資料

核酸的提取及瓊脂糖凝膠電泳

名目核酸組成理化性質(zhì)核酸分別、純化的原則核酸提取的根本步驟材料預(yù)備細(xì)胞裂解分別、純化沉淀溶解DNA提取的常用方法RNA提取的常用方法核酸的保存瓊脂糖凝膠電泳

核酸DNARNAGenomicDNA(原核、真核、病毒)細(xì)胞器DNA(葉綠體、線粒體等)質(zhì)粒DNA(細(xì)菌、放線菌等)mRNA(1%-5%)rRNA(80%-85%)tRNA(小分子RNA)(15%-20%)核酸(nucleicacid)核酸的提取是分子生物學(xué)試驗(yàn)技術(shù)中最重要、最根本的操作。核酸的理化性質(zhì)理化性質(zhì)DNA化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，物理上易碎，粘度大RNA化學(xué)性質(zhì)比DNA活潑，易受RNA酶的污染溶解性

均溶于水不溶于一般有機(jī)溶劑,在70%乙醇中形成沉淀

核酸分別、純化原則1、保持核酸分子一級(jí)構(gòu)造的完整性溫度不要太高把握pH值范圍(pH值5-9)保持確定離子強(qiáng)度削減物理因素對(duì)核酸的機(jī)械剪切力核酸分別、純化原則核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級(jí)構(gòu)造。所用器械和一些試劑需高溫滅菌提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑2、防止核酸的生物降解DNA酶抑制劑金屬離子螯合劑：DNA酶需要金屬二價(jià)離子Mg2+、Ca2+的激活，常用EDTA(乙二胺四乙酸)離子螯合劑，可抑制DNA酶活性。陰離于型外表活性劑SDS除對(duì)核酸酶有抑制作用外，還能使蛋白質(zhì)變性，并與變性蛋白結(jié)合成帶負(fù)電荷的復(fù)合物，該復(fù)合物有核酸酶抑制劑作用。RNA酶〔RNAase)抑制劑

DEPC(二乙基焦碳酸鹽)粘性液體，很強(qiáng)的核酸酶抑制劑。與蛋白質(zhì)中His結(jié)合使蛋白變性。使用留意：1.DEPC也能破壞單鏈核酸中大局部腺嘌呤環(huán)。2.簡(jiǎn)潔降解，保存在4℃或液氮中；3.劇毒。1：手指頭2：槍頭3：水/緩沖液4：試驗(yàn)臺(tái)面5：內(nèi)源Rnase6：RNA樣品7：質(zhì)粒抽提8：RNA保存9：陽(yáng)離子(Ca,Mg)10：后續(xù)試驗(yàn)所用的酶Rnase污染的10大來(lái)源DNA提取的根本步驟I.材料預(yù)備II.裂解III.分別、純化IV.沉淀或吸附核酸V.溶解材料預(yù)備使用新穎材料，樣品材料不要反復(fù)凍融提取血液基因組DNA時(shí)，要選擇有核細(xì)胞〔白細(xì)胞〕含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集基因組DNA的提取細(xì)胞裂解

裂解液經(jīng)典的裂解液幾乎都含有去污劑和鹽，可以抑制樣品中的核酸酶含蛋白酶的裂解方法：基因組DNA高濃度蛋白變性劑的裂解方法：RNA含CTAB的裂解法：富含多糖的樣品的基因組DNA含SDS堿裂解法：質(zhì)粒DNA核酸分別、純化蛋白質(zhì)的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑變性〔SDS、異硫氰酸胍等〕高鹽洗滌核酸-蛋白質(zhì)參與NaCl后，破壞靜電吸力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚；蛋白酶處理核酸分別、純化多糖的去除：高鹽法：用乙醇沉淀時(shí)，在待沉淀溶液中參與1/2體積的5MNaCl，高鹽可溶解多糖。用多糖水解酶將多糖降解。在提取緩沖液中加確定量的氯苯，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖。核酸沉淀、溶解重新調(diào)整核酸的濃度；去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。乙醇優(yōu)點(diǎn)：對(duì)鹽類沉淀少，沉淀中所含乙醇易揮發(fā)除去，不影響以后試驗(yàn)。缺點(diǎn)：需要量大，一般要求低溫操作。異丙醇優(yōu)點(diǎn)：需體積小，速度快，適于濃度低、體積大的DNA樣品沉淀。一般不需低溫。缺點(diǎn)：易使鹽類、蔗糖與DNA共沉淀．異丙醇難以揮發(fā)除去。所以，最終用70％乙醇漂洗。有機(jī)沉淀劑核酸的保存(1)對(duì)DNA①DNA樣品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存；②長(zhǎng)期保存樣品中可參與1滴氯仿。(2)對(duì)RNA①RNA樣品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或雙蒸滅菌水中，-70℃保存;②長(zhǎng)期保存可以沉淀形式貯于乙醇中;DNA提取的常用方法

基因組DNA的提取

SDS法其它原理基因組DNA－SDS法SDS在高溫〔55～65℃〕條件下能裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。組份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClSDS終濃度100mM20mM1.4M2%(W/V)SDS提取緩沖液的配方Tris-HCl〔pH8.0〕供給一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl供給一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNA充分溶解，存在于液相中；SDS裂解細(xì)胞，使蛋白變性，染色體離析；吸附材料結(jié)合法：依據(jù)核酸分別純化方式的不同有：高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫。快捷高效。低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的試驗(yàn)。磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物，從而到達(dá)分別目的。其他方法硅質(zhì)材料陰離子交換樹(shù)脂磁珠低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的試驗(yàn)。陰離子交換樹(shù)脂磁珠低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的試驗(yàn)。陰離子交換樹(shù)脂磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物，從而到達(dá)分別目的。磁珠低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的試驗(yàn)。陰離子交換樹(shù)脂磁珠硅質(zhì)材料高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫?？旖莞咝А９栀|(zhì)材料低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的試驗(yàn)。陰離子交換樹(shù)脂高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫。快捷高效。硅質(zhì)材料陰離子交換樹(shù)脂低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的試驗(yàn)。陰離子交換樹(shù)脂陰離子交換樹(shù)脂低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的試驗(yàn)。陰離子交換樹(shù)脂磁珠磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物，從而到達(dá)分別目的。磁珠Trizol是直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA的試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍，酚等物質(zhì)，異硫氰酸胍能快速溶解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞構(gòu)造裂開(kāi)。核酸由于核蛋白二級(jí)構(gòu)造的破壞而解離下來(lái)。異硫氰酸胍同時(shí)抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶，保持RNA的完整性。TRIZOL法提RNA目前有不少商業(yè)化的核酸抽提試劑盒可供選用，具體操作步驟參考各種產(chǎn)品說(shuō)明書。問(wèn)題一：DNA降解材料不新穎、反復(fù)凍融或細(xì)胞年輕提取操作過(guò)于猛烈，DNA被打斷外源核酸酶污染低溫保存，避開(kāi)反復(fù)凍融液氮研磨或勻漿組織，應(yīng)在解凍前參與裂解緩沖液增加裂解液中螯合劑的含量細(xì)胞裂解后操作應(yīng)盡量輕柔試劑用無(wú)菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌DNA分裝保存于緩沖液，避開(kāi)反復(fù)凍融核酸提取常見(jiàn)的問(wèn)題問(wèn)題二：DNA樣品不純DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反響DNA中殘留有金屬離子重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)增加70％乙醇洗滌的次數(shù)〔2-3次〕試驗(yàn)材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗滌時(shí)DNA喪失盡量選用新穎〔幼嫩〕的材料動(dòng)植物要?jiǎng)驖{研磨充分，裂解時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)〔對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌可增加PK的用量〕低溫沉淀，延長(zhǎng)沉淀時(shí)間加幫助物，促進(jìn)沉淀洗滌時(shí)，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒問(wèn)題三：DNA提取量少RNA提取常見(jiàn)問(wèn)題一：樣品不純

蛋白多糖多酚DNA離子保證徹底的裂解和確定轉(zhuǎn)數(shù)確定時(shí)間的離心增加有機(jī)溶劑抽提的次數(shù)，用吸附柱純化參與不含RNase的DNase處理增加洗滌次數(shù)RNA提取常見(jiàn)問(wèn)題二：得率低

樣品太多或太少RNA在柱子上未洗出洗出液中有酒精削減或增加樣品使用量參與RNaseFree,放置幾分鐘再離心漂洗后再次離心RNA提取常見(jiàn)問(wèn)題三：降解

樣品不新穎或保存不當(dāng)RNase污染RNA溶液儲(chǔ)存不當(dāng)取新穎的樣品；取樣后立刻放入液氮或儲(chǔ)存液保存研磨樣品準(zhǔn)時(shí)補(bǔ)充液氮嚴(yán)格處理相應(yīng)的器具和試劑-70℃凍存，分裝使用為了檢測(cè)提取核酸的濃度和內(nèi)參，需要連續(xù)做瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)試驗(yàn)原理〔1〕DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。分子質(zhì)量越小跑得越快，嚴(yán)密構(gòu)型快于松散型開(kāi)環(huán)分子或線性分子，從而可以分別大小不同的DNA或RNA分子?！?〕瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小準(zhǔn)備于瓊脂糖的濃度。濃度越高，孔隙越小，其區(qū)分力氣就越強(qiáng)。瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠緩沖液〔1〕制備凝膠和膠板：100ml(1×TBE)+1g瓊脂糖〔三角瓶〕，煮膠，溶解，冷卻至60℃(不燙手)，加EB替代物，倒板(4-6mm)，室溫下充分凝固，豎直拔下梳子?！?〕加樣：5μl質(zhì)粒DNA+1μlloadingbuffer，混勻5μlPCR產(chǎn)物+1μlloadingbuffer，混勻〔3〕電泳：電壓80-120V，留意電極方向15min〔4〕觀看：紫外透射下觀看。電泳常見(jiàn)問(wèn)題分析DNA降解：避開(kāi)核酸酶污染。電泳緩沖液陳舊：電泳緩沖液屢次用后，離子強(qiáng)度降低，pH值上升，緩沖力氣減弱，從而影響電泳效果。建議常常更換電泳緩沖液。DNA變性：電泳前勿加熱，可以在電泳儀上面放冰袋，避開(kāi)溫度高變性條帶淺，Marker彌散了---那要么就是膠的問(wèn)題，要不就是buffer的問(wèn)題。