薄層色譜法實(shí)驗(yàn)

薄層色譜法實(shí)驗(yàn)1參考文獻(xiàn)ChP-2020版通則0502薄層色譜法定義：薄層色譜法系將供試品溶液點(diǎn)于薄層板上，在展開(kāi)容器內(nèi)用展開(kāi)劑展開(kāi)，使供試品所含成分分離，所得色譜圖與適宜的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)按同法所得的色譜圖對(duì)比。2準(zhǔn)備工作2.1儀器與材料2.1.1薄層板2.1.1.1分類固定相中可加入黏合劑、熒光劑。硅膠薄層板常用的有硅膠G、硅膠GF254、硅膠H、硅膠HF254。在保證色譜質(zhì)量的前提下，可對(duì)薄層板進(jìn)行特別處理和化學(xué)改性以適應(yīng)分離的要求，可用實(shí)驗(yàn)室自制的薄層板。圖2-1-1-1薄層板分類2.1.1.2薄層板要求1）固定相顆粒大小一般要求粒徑為10~40μm。2）玻板應(yīng)光滑、平整，洗凈后不附水珠。圖2-1-2-1薄層硅膠板2.1.2點(diǎn)樣器一般釆用微升毛細(xì)管或手動(dòng)、半自動(dòng)、全自動(dòng)點(diǎn)樣器材。圖2-2-1全自動(dòng)點(diǎn)樣儀2.1.3展開(kāi)容器上行展開(kāi)一般可用適合薄層板大小的專用平底或雙槽展開(kāi)缸，展開(kāi)時(shí)須能密閉。水平展開(kāi)用專用的水平展開(kāi)槽。圖2-1-3-1高硼硅玻璃層析缸（左側(cè)雙槽，右側(cè)單槽）2.1.4顯色裝置1）噴霧顯色應(yīng)使用玻璃噴霧瓶或?qū)Ｓ脟婌F器，要求用壓縮氣體使顯色劑呈均勻細(xì)霧狀噴出；2）浸漬顯色可用專用玻璃器械或用適宜的展開(kāi)缸代用；3）蒸氣熏蒸顯色可用雙槽展開(kāi)缸或適宜大小的干燥器代替。圖2-4-1三角薄層噴瓶2.1.5檢視裝置為裝有可見(jiàn)光、254nm及365nm紫外光光源及相應(yīng)的濾光片的暗箱，可附加攝像設(shè)備供拍攝圖像用。暗箱內(nèi)光源應(yīng)有足夠的光照度。圖2-5-1BiostepDD70薄層色譜成像系統(tǒng)2.1.6薄層色譜掃描儀系指用一定波長(zhǎng)的光對(duì)薄層板上有吸收的斑點(diǎn)，或經(jīng)激發(fā)后能發(fā)射出熒光的斑點(diǎn)，進(jìn)行掃描，將掃描得到的譜圖和積分?jǐn)?shù)據(jù)用于物質(zhì)定性或定量的分析儀器。圖2-1-6-1薄層色譜掃描儀2.2溶劑1）使用的溶劑必須是“分析純”或“色譜純”；2）溶劑組成采用體積量比（如正丁醇-冰乙酸-水=4：1：1，V/V/V），或者絕對(duì)量（如18ml甲苯+2ml甲醇）。3）配制總量應(yīng)足以使薄層板的浸入深度約為5mm?？梢允孪攘咳≌归_(kāi)缸的底座面積×0.5mm得到最少需要的溶劑體積參考值。4）展開(kāi)劑要求新鮮配制，不要多次反復(fù)使用，如需分層，則按要求放置分層后取需要的一相（上層或下層），備用。2.2.1溶劑2.2.1.1溶劑的選擇考慮分離成分的極性、溶解度、吸附度。先加入極性較小的溶劑，若不容再加入少量極性大的溶劑一般根據(jù)相似相溶原則，需要注意，極性相差大的不混溶。混合溶劑通常使用一個(gè)高極性和低級(jí)性溶劑組成的混合溶劑。查閱文獻(xiàn)，目標(biāo)化合物適用于什么樣的展開(kāi)劑，可用文獻(xiàn)條件作為初始條件測(cè)試，根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整展開(kāi)劑的配比，直到找到一個(gè)分離效果好的展開(kāi)劑。一般把兩種溶劑混合時(shí)，采用高極性/低極性的體積比為1/3的混合溶劑,如果有分開(kāi)的跡象，再調(diào)整比例（或者加入第三種溶劑），達(dá)到最佳效果；如果沒(méi)有分開(kāi)的跡象（斑點(diǎn)較“拖”），最好是換溶劑。2.2.1.2溶劑極性參數(shù)表名稱介電常數(shù)極性環(huán)已烷2-0.2正已烷1.90.0甲苯2.42.4二甲苯2.42.5苯2.32.7二氯甲烷9.13.1異丙醇18.33.91）一般來(lái)說(shuō)，弱極性溶劑體系的基本兩相由正己烷和水組成，再根據(jù)需要加入甲醇、乙醇，乙酸乙酯來(lái)調(diào)節(jié)溶劑系統(tǒng)的極性，以達(dá)到好的分離效果，適合于生物堿、黃酮、萜類等的分離；2）中等極性的溶劑體系由氯仿和水基本兩相組成，由甲醇、乙醇，乙酸乙酯等來(lái)調(diào)節(jié)，適合于蒽醌、香豆素，以及一些極性較大的木脂素和萜類的分離；3）強(qiáng)極性溶劑，由正丁醇和水組成，也靠甲醇、乙醇，乙酸乙酯等來(lái)調(diào)節(jié)，適合于極性很大的生物堿類化合物的分離。2.2.2展開(kāi)劑2.2.2.1展開(kāi)劑的選擇對(duì)的所需成分有良好的溶解性；可使成分間分開(kāi)（分離度好）；待測(cè)組分的Rf在0.2~0.8之間，定量測(cè)定在0.3～0.5之間；與待測(cè)組分或吸附劑不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；沸點(diǎn)適中，黏度較?。徽归_(kāi)后組分斑點(diǎn)圓且集中；混合溶劑最好用新鮮配制。物質(zhì)分子化學(xué)結(jié)構(gòu)中，通常由較極性部分和非極性部分兩部分。例如下面以苯丙烷為極性小部分，隨著極性基團(tuán)部分的增加，總體的極性就增加，展開(kāi)劑極性也增加了。以下分開(kāi)討論不同化合物極性情況及其對(duì)應(yīng)的展開(kāi)劑。

3操作方法3.1薄層板制備3.2點(diǎn)樣除另有規(guī)定外，在潔凈干燥的環(huán)境中，用專用毛細(xì)管或配合相應(yīng)的半自動(dòng)、自動(dòng)點(diǎn)樣器械點(diǎn)樣于薄層板上。接觸點(diǎn)樣時(shí)注意勿損傷薄層表面?？捎脤Ｓ冒胱詣?dòng)或自動(dòng)點(diǎn)樣器械噴霧法點(diǎn)樣。點(diǎn)間距離可視斑點(diǎn)擴(kuò)散情況以相鄰斑點(diǎn)互不干擾為宜。圖3-2-1點(diǎn)樣要求3.3展開(kāi)將點(diǎn)好供試品的薄層板放入展開(kāi)缸中，浸入展開(kāi)劑，密閉。溶劑前沿達(dá)到規(guī)定的展距，取出薄層板，晾干，待檢測(cè)。展開(kāi)前如需要溶劑蒸氣預(yù)平衡，可在展開(kāi)缸中加入適量的展開(kāi)劑，密閉，一般保持15~30分鐘。溶劑蒸氣預(yù)平衡后，應(yīng)迅速放入載有供試品的薄層板，立即密閉，展開(kāi)。如需使展開(kāi)缸達(dá)到溶劑蒸氣飽和的狀態(tài)，則須在展開(kāi)缸的內(nèi)壁貼與展開(kāi)缸高、寬同樣大小的濾紙，一端浸入展開(kāi)劑中，密閉一定時(shí)間，使溶劑蒸氣達(dá)到飽和再如法展開(kāi)。必要時(shí)，可進(jìn)行二次展開(kāi)或雙向展開(kāi)，進(jìn)行第二次展開(kāi)前，應(yīng)使薄層板殘留的展開(kāi)劑完全揮干。圖3-3-1展開(kāi)要求3.4顯色與檢視3.5記錄薄層色譜圖像一般可采用攝像設(shè)備拍攝，以光學(xué)照片或電子圖像的形式保存。也可用薄層色譜掃描儀掃描或其他適宜的方式記錄相應(yīng)的色譜圖。4系統(tǒng)適用性試驗(yàn)按各品種項(xiàng)下要求對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，即用供試品和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行試驗(yàn)和調(diào)整，應(yīng)符合規(guī)定的要求。4.1比移值（Rf）系指從基線至展開(kāi)斑點(diǎn)中心的距離與從基線至展開(kāi)劑前沿的距離的比值。除另有規(guī)定外，雜質(zhì)檢查時(shí)，各雜質(zhì)斑點(diǎn)的比移值Rf以在0.2~0.8之間為宜。圖4-4-1展開(kāi)要求RfL1：從基線至展開(kāi)劑前沿的距離；L2：從基線至展開(kāi)斑點(diǎn)中心的距離。4.2檢出限系指限量檢查或雜質(zhì)檢查時(shí)，供試品溶液中被測(cè)物質(zhì)能被檢出的最低濃度或量。一般采用已知濃度的供試品溶液或?qū)φ諛?biāo)準(zhǔn)溶液，與稀釋若干倍的自身對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液在規(guī)定的色譜條件下，在同一薄層板上點(diǎn)樣、展開(kāi)、檢視，后者顯清晰可辨斑點(diǎn)的濃度或量作為檢出限。4.3分離度（或稱分離效能）鑒別時(shí)，供試品與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜中的斑點(diǎn)均應(yīng)清晰分離。當(dāng)薄層色譜掃描法用于限量檢查和含量測(cè)定時(shí)，要求定量峰與相鄰峰之間有較好的分離度，分離度(R)的計(jì)算公式為：R=2(d2-d1)/(W1+W2)式中：d2：為相鄰兩峰中后一峰與原點(diǎn)的距離；d1：為相鄰兩峰中前一峰與原點(diǎn)的距離；W1及W2：為相鄰兩峰各自的峰寬。除另有規(guī)定外，分離度應(yīng)大于1.0。在化學(xué)藥品雜質(zhì)檢查的方法選擇時(shí)，可將雜質(zhì)對(duì)照品用供試品自身稀釋的對(duì)照溶液溶解制成混合對(duì)照溶液，也可將雜質(zhì)對(duì)照品用待測(cè)組分的對(duì)照品溶液溶解制成混合對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液，還可釆用供試品以適當(dāng)?shù)慕到夥椒ǐ@得的溶液，上述溶液點(diǎn)樣展開(kāi)后的色譜圖中，應(yīng)顯示清晰分離的斑點(diǎn)。4.4相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差薄層掃描含量測(cè)定時(shí)，1）同一供試品溶液在同一薄層板上平行點(diǎn)樣的待測(cè)成分的峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)≤5.0%；2）需顯色后測(cè)定的或者異板的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)≤10.0%。5測(cè)定法5.1鑒別按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法，制備供試品溶液和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液，在同一薄層板上點(diǎn)樣、展開(kāi)與檢視，供試品色譜圖中所顯斑點(diǎn)的位置和顏色（或熒光）應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖的斑點(diǎn)一致。必要時(shí)化學(xué)藥品可采用供試品溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液混合點(diǎn)樣、展開(kāi)，與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相應(yīng)斑點(diǎn)應(yīng)為單一、緊密斑點(diǎn)。5.2限量檢查與雜質(zhì)檢查按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法，制備供試品溶液和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液，并按規(guī)定的色譜條件點(diǎn)樣、展開(kāi)和檢視。供試品溶液色譜圖中待檢查的斑點(diǎn)與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)斑點(diǎn)比較，顏色（或熒光）不得更深；或照薄層色譜掃描法操作，測(cè)定峰面積值，供試品色譜圖中相應(yīng)斑點(diǎn)的峰面積值不得大于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積值。含量限度檢查應(yīng)按規(guī)定測(cè)定限量?；瘜W(xué)藥品雜質(zhì)檢查可釆用雜質(zhì)對(duì)照法、供試品溶液的自身稀釋對(duì)照法或兩法并用。供試品溶液除主斑點(diǎn)外的其他斑點(diǎn)與相應(yīng)的雜質(zhì)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液或系列濃度雜質(zhì)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液的相應(yīng)主斑點(diǎn)比較，不得更深，或與供試品溶液自身稀釋對(duì)照溶液或系列濃度自身稀釋對(duì)照溶液的相應(yīng)主斑點(diǎn)比較，不得更深。通常應(yīng)規(guī)定雜質(zhì)的斑點(diǎn)數(shù)和單一雜質(zhì)量，當(dāng)釆用系列自身稀釋對(duì)照溶液時(shí)，也可規(guī)定估計(jì)的雜質(zhì)總量。5.3含量測(cè)定照薄層色譜掃描法，按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法，制備供試品溶液和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液，并按規(guī)定的色譜條件點(diǎn)樣、展開(kāi)、掃描測(cè)定?；?qū)⒋郎y(cè)色譜斑點(diǎn)刮下經(jīng)洗脫后，再用適宜的方法測(cè)定。6薄層色譜掃描法系指用一定波長(zhǎng)的光照射在薄層板上，對(duì)薄層色譜中可吸收紫外光或可見(jiàn)光的斑點(diǎn)，或經(jīng)激發(fā)后能發(fā)射出熒光的斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，將掃描得到的圖譜及積分?jǐn)?shù)據(jù)用于鑒別、檢查或含量測(cè)定?？筛鶕?jù)不同薄層色譜掃描儀的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，按照規(guī)定方式掃描測(cè)定，一般選擇反射方式，采用吸收法或熒光法。除另有規(guī)定外，含量測(cè)定應(yīng)使用市售薄層板。掃描方法可采用單波長(zhǎng)掃描或雙波長(zhǎng)掃描。如采用雙波長(zhǎng)掃描，應(yīng)選用待測(cè)斑點(diǎn)無(wú)吸收或最小吸收的波長(zhǎng)為參比波長(zhǎng)，供試品色譜圖中待測(cè)斑點(diǎn)的比移值（Rf值）、光譜掃描得到的吸收光譜圖或測(cè)得的光譜最大吸收和最小吸收應(yīng)與對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液相符，以保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。薄層色譜掃描定量測(cè)定應(yīng)保證供試品斑點(diǎn)的量在線性范圍內(nèi)，必要時(shí)可適當(dāng)調(diào)整供試品溶液的點(diǎn)樣量，供試品與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)同板點(diǎn)樣、展開(kāi)、掃描、測(cè)定和計(jì)算。薄層色譜掃描用于含量測(cè)定時(shí)，通常采用線性回歸二點(diǎn)法計(jì)算，如線性范圍很窄時(shí)，可用多點(diǎn)法校