局部給藥制劑控制菌檢查

局部給藥制劑控制菌檢查金黃色葡萄球菌檢查

目錄局部給藥制劑的介紹金黃色葡萄球菌的介紹微球菌科、葡萄球菌屬生物學分類樣品信息介紹操作程序生化試驗及結果判定局部給藥制劑的定義

按照局部給藥制劑微生物限度檢查規(guī)定工作程序和檢驗操作程序，得到局部給藥制劑微生物限度檢查常規(guī)細菌計數(shù)、霉菌和酵母菌計數(shù)以及控制菌（銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌）檢查結果，并依據(jù)執(zhí)行標準判定結果是否符合規(guī)定并報告。操作及項目標準

環(huán)境潔凈度：應在10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進行，檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作。檢驗結果以1ml為單位報告，特殊品種可以最小包裝單位報告。培養(yǎng)溫度：本檢査法中霉菌及控制菌培養(yǎng)溫度為30?35℃供試品檢查時，如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活劑，應證明其有效性及對微生物無毒性。資料來源：2010年版《中國藥典》第二部附錄XIJ微生物限度檢查法P107局部給藥制劑的途徑和劑型★不經(jīng)胃腸道給藥的劑型（1）注射給藥如靜脈注射、肌內(nèi)注射、皮下注射和皮內(nèi)注射等。（2）呼吸道給藥如吸入劑、噴霧劑、氣霧劑等。（3）皮膚給藥如外用溶液劑、洗劑、搽劑、軟膏劑、糊劑、貼劑等。（4）粘膜給藥如滴眼劑、滴鼻劑、含漱劑、舌下片劑、栓劑、膜劑等。一般把直腸給藥也歸于粘膜給藥一類，如灌腸劑、栓劑、直腸用膠囊栓等。凝膠又稱凍膠。溶膠或溶液中的膠體粒子或高分子在一定條件下互相連接，形成空間網(wǎng)狀結構，結構空隙中充滿了作為分散介質(zhì)的液體，這樣一種特殊的分散體系稱作凝膠。軟膏用于皮膚的含脂類或油脂類物質(zhì)(如凡士林、豬油、羊毛脂)為基質(zhì)的半固體藥物制劑栓劑指藥物與適宜基質(zhì)制成的具有一定形狀的供人體腔道內(nèi)給藥的固體制劑。PPT模板下載：/moban/局部給藥制劑的常見劑型局部給藥制劑的分類4用于手術、燒傷或嚴重創(chuàng)傷的局部給藥制劑1235用于表皮或粘膜不完整的含藥材原粉的局部給藥制劑用于表皮或粘膜完整的含藥材原粉的局部給藥制劑陰道、尿道給藥制劑直腸給藥制劑6其他局部給藥制劑微生物限度標準直腸給藥制劑：細菌數(shù)：每1ml不得過100cfu霉菌和酵母菌數(shù)：每1ml不得過100cfu銅綠單孢菌：每1ml不得檢出金黃色葡萄球菌：每1ml不得檢出資料來源：2010年版《中國藥典》第二部附錄附錄XIJ微生物限度檢查法P115微生物限度標準產(chǎn)品介紹【藥品名稱】通用名稱：開塞露（含甘油）英文名稱：GlyceineEnema漢語拼音：Kaisailu成份：本品每支含主要成份甘油52.8-58.3%。輔料為：純化水性狀：本品為無色、澄清的粘稠液體作用類別：本品為緩解瀉藥類非處方藥藥品適應癥：用于便秘樣品信息規(guī)格：10ml/支有效期：24個月執(zhí)行標準：國家藥品標準WSI-XG-018-2011批準文號：國藥準字H44023815說明書修訂日期：2012年02年29日儲藏：遮光，密封，在干燥處保存不良反應：尚不明確禁忌：尚不明確請檢單品名開塞露批號141003規(guī)格/包裝規(guī)格10ml/瓶數(shù)量1瓶批準文號國藥準字H44023815請檢日期2014年4月2日檢查單位請檢人請檢目的檢查本品是否有金黃色葡萄球菌備注金黃色葡萄球菌的簡介金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是人類的一種重要病原菌，隸屬于葡萄球菌（Staphylococcus），有“嗜肉菌"的別稱，是革蘭氏陽性菌的代表，可引起許多嚴重感染。而對于金黃色葡萄球菌在速凍食品中的存在量，衛(wèi)生部于2011年11月24日公布食品安全國家標準《速凍面米制品》，允許金葡菌限量存在。病原微生物又可稱為病原菌，是指能入侵宿主引起感染的微生物，有細菌、真菌、病毒等。病原菌為什么會使人生病呢？是因為它們能產(chǎn)生致病物質(zhì)，造成宿主感染。如果不產(chǎn)生致病物質(zhì)，就是非病原菌。至于正常菌群，當與宿主處于生態(tài)平衡狀態(tài)，它們并不引起機體的感染，故屬于非病原菌范疇。但是，在特定條件下，因為菌群失調(diào)、宿主免疫功能低下或菌群寄居部位改變造成了生態(tài)失調(diào)狀態(tài)，正常菌群也能引起感染，這樣它們又應看成病原菌。為此，將這些正常菌群稱為條件性病原菌或機會性病原菌，意思是在特殊條件下或遇到合適機會時，它們也可以具有病原菌的特性，造成人類感染性疾病。什么是病原菌？致病性金黃色葡萄球菌為條件致病菌，菌株致病力的強弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶：

a.溶血素：外毒素，分α、β、γ、δ四種，能損傷血小板，破壞溶酶體，引起肌體局部缺血和壞死；

b.殺白細胞素：可破壞人的白細胞和巨噬細胞；

c.血漿凝固酶：當金黃色葡萄球菌侵入人體時，該酶使血液或血漿中的纖維蛋白沉積于菌體表面或凝固，阻礙吞噬細胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化與此酶有關；

d.脫氧核糖核酸酶：金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的脫氧核糖核酸酶能耐受高溫，可用來作為依據(jù)鑒定金黃色葡萄球菌；

e.腸毒素：金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生數(shù)種引起急性胃腸炎的蛋白質(zhì)性腸毒素，分為A、B、C、D、E五種。什么是條件致病菌？？？條件致病菌又稱為機會致病菌，在某種特定的條件下可致病的細菌，稱為條件致病菌，條件致病菌是人體的正常菌群，當其集聚部位改變、機體抵抗力降低或菌群失調(diào)時可致病，如病形桿菌。致病性

金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見的病原菌，臨床表現(xiàn)多種多樣，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。葡萄球菌皮膚感染分布在自然界中廣泛存在，空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可找到。作為人和動物的常見病原菌，其主要存在于人和動物的鼻腔、咽喉、頭發(fā)上，50%以上健康人的皮膚上都有金黃色葡萄球菌存在。因而，食品受其污染的機會很多。傳播媒介為被該菌污染的食品，主要為淀粉類(如剩飯、米面、粥等)、牛乳及乳制品，以及魚、肉、蛋類等。被污染的食物在室溫20℃-22℃放置5小時以上時，病菌大量繁殖，并產(chǎn)生腸毒素。生物學分類域： 細菌域Bacteria門： 厚壁菌門Firmicutes綱： 芽孢桿菌綱Bacilli目： 芽孢桿菌目Bacillales科： 微球菌科Staphylococcaceae屬： 葡萄球菌屬Staphylococcus種： 金黃色葡萄球菌S.aureus伯杰氏手冊681金黃色葡萄球菌(StaphyloccocusaureusRosenbach)1、形態(tài)與染色：(staphylococcusaureus)典型的金黃色葡萄球菌為球型，直徑0.8μm左右，顯微鏡下排列成葡萄串狀。金黃色葡萄球菌無芽胞、鞭毛，大多數(shù)無莢膜。革蘭氏染色陽性。培養(yǎng)特性：金黃色葡萄球菌營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長良好，加少量葡萄糖或血液生長更旺盛需氧或兼性厭氧，最適生長溫度37℃，最適生長pH7.4。金黃色葡萄球菌有高度的耐鹽性，可在7.5～15%NaCl肉湯中生長。平板上菌落厚、有光澤、圓形凸起，直徑1-2mm。血平板菌落周圍形成透明的溶血環(huán)。微球菌科（MicrococcaeaePribram)

的特征細胞球狀，直徑0.5—3.5微米，可向幾個平面分裂為其特征，形成規(guī)則或不規(guī)則的堆團或立方堆，運動或不運動。無休眠期。革蘭氏陽性。化能異養(yǎng)菌，呼吸或發(fā)酵代謝。當分解葡萄糖時產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。好氧或兼性厭氧。營養(yǎng)要求是可變的。所有的菌株能在5%的NaCl中生長，有許多菌株能在10-15%的NaCl中生長。DNA的G+C含量范圍約為30~75克分子%同科菌屬：微球菌屬葡萄球菌屬動性球菌屬引起毒素型食物中毒分為：金黃色葡萄球菌表皮葡萄球菌腐生性葡萄球菌葡萄球菌屬（Staphylococcus）對于加工過的食品或食品加工設備而言，此菌或其腸毒素的存在通常作為衛(wèi)生條件差的一種指標。金黃色葡萄球菌的掃描電鏡照片葡萄球菌屬（StaphylococcusRosenba）的特征細胞球狀，直徑0.5-1.5微米。不運動，沒有休眠階段。革蘭氏陽性?；墚愷B(yǎng)菌，呼吸代謝和發(fā)酵代謝。產(chǎn)生細胞外酶和毒素?？伤舛喾N蛋白質(zhì)和含脂肪的底物?？赡芊纸怦R尿酸鹽和精氨酸。不形成吲哚。好氧生長要求氨基酸和維生素類。大多數(shù)在15%NaCl或40%的膽汁中可以生長。資料出自《伯杰氏手冊》669頁金黃色葡萄球菌生化特性：可分解葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。甲基紅反應陽性，VP反應弱陽性。許多菌株可分解精氨酸，水解尿素，還原硝酸鹽，液化明膠。金黃色葡萄球菌具有較強的抵抗力，對磺胺類藥物敏感性低，但對青霉素、紅霉素等高度敏感。項目進程表序號工作內(nèi)容日期責任人11、霉菌計數(shù)備料2、金黃色葡萄球菌增菌備料2014-4-2AB21、金黃色葡萄球菌的增菌接種2、.金黃色葡萄球菌的分離培養(yǎng)備料2014-4-9AB31、金黃色葡萄球菌增菌結果的觀察、記錄霉菌數(shù)點計，記錄2、金黃色葡萄球菌的分離劃線3、純培養(yǎng)備料（課外接種）2014-4-14BA41、金黃色葡萄球菌的分離培養(yǎng)的結果的觀察、記錄金黃色葡萄球菌的純培養(yǎng)結果的觀察、記錄2、革蘭氏染色鏡檢3、血漿凝固酶試驗的接種、培養(yǎng)2014-4-16AB51、金黃色葡萄球菌的生化試驗觀察，記錄2、填寫原始記錄，報告2014-4-21AB供試品供試液亞碲酸鈉肉湯（或營養(yǎng)肉湯）卵黃高鹽瓊脂平板甘露醇高鹽瓊脂平板營養(yǎng)瓊脂斜面革蘭氏染色鏡檢血漿凝固酶試驗報告培養(yǎng)溫度：36±1℃培養(yǎng)時間：18~24h，必要時可延長至48h培養(yǎng)溫度：36±1℃培養(yǎng)時間：24~72h分離培養(yǎng)增菌培養(yǎng)純培養(yǎng)流程圖供試液的制備取樣品10ml加入用量筒量取無菌水90ml于空瓶中用玻璃棒攪拌，使混合均勻供試液陽性：10ml供試液+1ml菌液樣品：10ml供試液陰性：10ml緩沖液營養(yǎng)肉湯（亞碲酸鈉）增菌液各100毫升供試液緩沖液營養(yǎng)肉湯營養(yǎng)肉湯營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)溫度：36±1℃培養(yǎng)時間：18~24h必要時可延至48h陰性對照應無菌生長增菌增菌備料單營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基100mlX2玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基150ml氯化鈉蛋白胨水150ml移液管1mlX510mlx2試管2支平皿x8玻璃棒x1100ml量筒x1空三角瓶營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基名稱用量作用胨10g營養(yǎng)物質(zhì)，提供碳源、氮源、維生素和生長因子牛肉浸出粉3g氯化鈉5g調(diào)節(jié)滲透壓水1000ml用于飽和培養(yǎng)基亞碲酸鹽肉湯培養(yǎng)基：臨用前，取滅菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，每100m加入新配置的1%亞碲酸鈉（鉀)l試液0.2ml，混勻，即得。亞碲酸鈉的作用是一直其他菌生長，起選擇作用取上述成份混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH

為弱堿性，煮沸，濾清，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.2±0.2,分裝，滅菌。分離培養(yǎng)增菌培養(yǎng)液陽性樣品四驅(qū)劃線卵黃氯化鈉瓊脂平板甘露醇瓊脂平板以接種環(huán)沾取1-2環(huán)培養(yǎng)液，劃線接種培養(yǎng)溫度：36±1℃培養(yǎng)時間：24~72h分離培養(yǎng)備料單平皿1x4卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基40ml甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基40ml卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基：名稱用量用處胨6.0g提供碳源、氮源、維生素和生長因子牛肉浸出粉1.8g10%氯化鈉卵黃液100ml金黃色葡萄球菌具有卵磷脂酶?？煞纸饴蚜字扇隄岘h(huán)瓊脂23g凝固劑氯化鈉30g具有選擇和調(diào)節(jié)滲透壓的作用水650ml飽和培養(yǎng)基除10%氯化鈉卵黃液外，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH7.6±0.1,待冷至60℃以無菌操作加入10%氯化鈉卵黃液，充分混勻，勿振搖，傾注平皿。10%氯化鈉卵黃液的制備取新鮮雞蛋1個，以無菌操作取出卵黃，放入10%氯化鈉溶液100ml中，充分混勻。甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基名稱用量作用胨10g提供碳源、氮源、維生素和生長因子牛肉浸出粉1g酚磺酞指示劑2.5mlpH指示劑瓊脂15~20g凝固劑甘露醇10gD—甘露醇為可發(fā)酵的糖類氯化鈉75g具有選擇和調(diào)節(jié)滲透壓的作用水1000ml飽和培養(yǎng)基除甘露醇、指示液和瓊脂外，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH使滅菌后為7.4±0.2，加入瓊脂，加熱溶化后，濾過，分裝，滅菌，冷至60℃，傾注平皿。金黃色葡萄球菌在兩種選擇性培養(yǎng)基上菌落的形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)特征卵黃氯化鈉瓊脂金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，光滑濕潤，外周有分解卵黃磷脂后產(chǎn)生的乳濁圈，菌落直徑1~2cm甘露醇氯化鈉瓊脂金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，光滑濕潤，外周有黃色環(huán)，菌落直徑0.7~1cm挑取疑似菌落接種于營養(yǎng)瓊脂斜面于36℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18~24h取斜面培養(yǎng)物進行革蘭氏染色，鏡檢營養(yǎng)肉湯于36℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18~24h純培養(yǎng)純培養(yǎng)備料單營養(yǎng)瓊脂斜面10mlx4營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基名稱用量作用胨10g提供碳源、氮維生素和生長因子牛肉浸出粉3g氯化鈉5調(diào)節(jié)滲透壓水1000ml飽和培養(yǎng)基取上述成分，混合。微溫溶解后，調(diào)節(jié)pH為弱堿性，煮沸，濾清，加入14g瓊脂，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.2±0.2，滅菌。革蘭氏染色、鏡檢1、以接種環(huán)蘸取無菌水與潔凈載玻片上，取上述疑似菌落的營養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物少許，制成均勻涂片，自然或微溫干燥，再通過火焰2~3次（載玻片不燙手）固定。2、滴加結晶紫染液，染色1min，水洗。3、滴加碘液，媒染1min，水洗，以濾紙吸干余水。4、滴加95%乙醇，脫色20~30s，水洗。5、滴加沙黃染液，復染1min,待干后，鏡檢。6、染色結果：革蘭氏陽性菌呈藍紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，球狀。生化試驗

原理：血漿凝固酶是一種含有枸櫞酸鈉或肝素抗凝劑的人或兔的血漿發(fā)生凝固的酶類物質(zhì)。致病性葡萄球菌大多能產(chǎn)生凝固酶，非致病葡萄球菌不產(chǎn)生此酶，試管血漿呈凝固者為陽性反應，不凝固者為陰性反應。

陽性陰性致病菌血漿凝固酶使血漿凝固分類游離性凝固酶分泌至細菌體外被血漿中凝固酶反應因子激活，形成葡萄球菌凝血酶。使纖維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白，導致血漿凝固。采用試管法檢測結合型凝固酶在菌體表面與纖維蛋白原結合，使纖維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白。引起細菌凝集采用玻片法檢測操作步驟（供試液制備）1、軟膏、乳膏劑先將已備妥的含5g司盤80、3g單硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80的混合物加熱至融化，待冷至45℃時，加入供試品5g（或5ml），立即用玻璃棒攪拌均勻，分次少量慢慢加入45℃的pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至80ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1:20供試液2、油劑去供試品10ml，加入5~8ml無菌聚山梨酯80，搖勻，再加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml。3、取緩沖液90ml于空的三角瓶中，加入樣品10ml，用玻璃棒攪拌，使混合均勻，即得供試液。操作步驟（增菌培養(yǎng)）取營養(yǎng)肉湯（或亞碲酸鈉肉湯）培養(yǎng)基2份，每份100ml，1份加入10ml供試液，另一份加入與供試液等量的pH7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液作為陰性對照，置36攝氏度培養(yǎng)18~24（必要時可延至48h;）。陰性對照應無菌生長。操作步驟（分離培養(yǎng)）分離培養(yǎng)將上述供試品增菌培養(yǎng)液，以接種環(huán)沾取1-2環(huán)培養(yǎng)液，劃線接種于卵黃氯化鈉瓊脂平板或甘露醇氯化鈉瓊脂平板上，置36±1℃培養(yǎng)24-72h。當供試品分離平板無菌落生長，或有菌落生長但不同于下列表格的特征時，可報告為1g或1ml供試品未檢出金黃色葡萄球菌。純培養(yǎng)當供試品分離平板生長菌落與上表所列菌落特征相似或疑似時，應選取2-3個以上菌落，分別用接種針輕輕蘸取菌落中心表面培養(yǎng)物，接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，于36攝氏度培養(yǎng)18-24h，取營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物進行革蘭氏染色鏡檢，以及接種營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中于36攝氏度培養(yǎng)18-24h，做血漿凝固酶試驗。血漿凝固酶試驗試管法：取無菌試管（100mmx100mm）