納米材料、金納米顆粒、尺寸密度可控、功能化修飾、分子分離篩選

摘要生物離子通道因其具有高度的選擇性與特異性，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同的分子與離子的分離篩選，但其必須依靠磷脂雙分子層，具有不穩(wěn)定性，這就大大限制了它的應(yīng)用。近年來,隨著生物技術(shù)和納米科學(xué)的不斷進(jìn)步，基于納米材料構(gòu)筑的功能分子分離篩選系統(tǒng)愈發(fā)成為相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。人們利用納米材料機(jī)械強(qiáng)度高、形貌和表面功能化多樣性，以及與生物分子和其活動(dòng)區(qū)域相似的尺度和維度等優(yōu)點(diǎn)，設(shè)計(jì)和開發(fā)了具有多靈敏度和選擇性的生物器件。本文工作主要包括以下兩個(gè)方面：1.在陽極氧化鋁（AAO）納米孔道內(nèi)可控的修飾單分散性的金納米顆粒(AuNPs)。本實(shí)驗(yàn)利用聚多巴胺（PDA）的粘附性和還原性與氯金酸的氧化性，通過簡(jiǎn)單真空抽濾的方法在AAO納米孔道內(nèi)壁上修飾單分散的金納米顆粒。同時(shí)，通過調(diào)節(jié)聚多巴胺溶液的濃度、氯金酸溶液的濃度等實(shí)驗(yàn)條件，成功地調(diào)節(jié)和控制了AAO孔道內(nèi)表面附著的金納米顆粒的尺寸（30-80nm）和分布密度（109-1012m-2）。2.對(duì)AAO孔道進(jìn)行功能化修飾，構(gòu)筑了基于AAO納米孔道為基底的分子分離篩選體系。利用金原子與巰基結(jié)合形成Au-S鍵，本實(shí)驗(yàn)首先在修飾金顆粒的AAO孔道內(nèi)選擇性的修飾了疏水分子二十二烷基硫醇（C22H46S），在電化學(xué)驅(qū)動(dòng)之后，檢測(cè)親水分子亞甲基藍(lán)與疏水分子阿米替林跨膜運(yùn)輸濃度。結(jié)果顯示經(jīng)疏水分子功能化修飾的AAO孔道能夠較好的分離篩選親、疏水分子。其次在修飾金顆粒的AAO孔道內(nèi)分別選擇性的修飾L/D-半胱氨酸（L/D-Cys），在電化學(xué)驅(qū)動(dòng)后，檢測(cè)牛血清蛋白(BSA)分子分別通過L-Cys與D-Cys修飾的AAO孔道的跨膜運(yùn)輸濃度。結(jié)果顯示經(jīng)手性半胱氨酸修飾的AAO孔道對(duì)BSA有選擇運(yùn)輸性。關(guān)鍵詞：納米材料、金納米顆粒、尺寸密度可控、功能化修飾、分子分離篩選

AbstractBiologicalionchannelscanseparateandscreendifferentmoleculesandionsbecauseofitshighselectivityandspecificity,buttheymustrelyonphospholipidbilayers,whichisunstableandgreatlylimitsitsapplication.Inrecentyear,withthecontinuousdevelopmentofbiotechnologyandnanoscience,functionalmolecularseparationandscreeningsystemsbasedonnanomaterialconstructionhavebecomearesearchhotspotinrelatedfields.Biomaterialswithmultiplesensitivitiesandselectivitieshavebeendesignedanddevelopedusingtheadvantagesofhighmechanicalstrength,morphologicalandsurfacefunctionaldiversityofnanomaterials,andsimilarscalesanddimensionstobiomoleculesandtheiractiveregions.Thispapermainlyincludesthefollowingtwoaspects:Monodispersegoldnanoparticles(AuNPs)arecontrollablymodifiedinanodizedaluminum(AAO)nanochannels.Inthisexperiment,themonodispersegoldnanoparticlesweremodifiedontheinnerwalloftheAAOnanoporebysimplevacuumfiltrationusingtheadhesionandreducibilityofpolydopamine(PDA)andtheoxidizingpropertyofchloroauricacid.Atthesametime,byadjustingtheconcentrationofpolydopaminesolutionandtheconcentrationofchloroauricacidsolution,thesize(30-80nm)anddistributiondensity(109-1012m)ofgoldnanoparticlesattachedtotheinnersurfaceofAAOchannelweresuccessfullyadjustedandcontrolled.FunctionalmodificationofAAOporestoconstructamolecularseparationscreeningsystembasedonAAOnanopores.TheAu-Sbondwasformedbythecombinationofagoldatomandasulfhydrylgroup.Inthisexperiment,thehydrophobicmoleculebehenylthiolwasselectivelymodifiedintheAAOchannelofthemodifiedgoldparticle.Afterelectrochemicaldriving,thetransmembranetransportconcentrationofthehydrophilicmolecularmethyleneblueandthehydrophobicmoleculeamitriptylinewasmeasured.TheresultsshowthattheAAOporesfunctionalizedbyhydrophobicmoleculescanbeusedtoisolateandscreenpro-andhydrophobicmolecules.Secondly,L/D-cysteine(L/D-Cys)wasselectivelymodifiedintheAAOchannelofthemodifiedgoldparticles.Afterelectrochemicaldriving,Transmembranetransportconcentrationsofbovineserumalbumin(BSA)moleculesthroughL-CysandD-CysmodifiedAAOchannelsweremeasured.TheresultsshowthattheAAOchannelmodifiedbychiralcysteinehasaselectivetransportabilitytoBSA.Keyword:Nanomaterials；goldnanoparticle；controllablesizeanddensity；functionalmodification；molecularseparationandscreening目錄第一章概述 51.1納米孔的概述 51.1.1生物納米孔 51.1.2固態(tài)納米孔 61.2固態(tài)納米孔/納米通道的制備 61.2.1徑跡刻蝕法 71.2.2模板法 71.2.3聚焦離子束（FIB）技術(shù) 71.3固態(tài)納米孔/納米通道生物功能化 81.4智能固態(tài)納米孔/納米通道的應(yīng)用 91.4.1、能量轉(zhuǎn)換 91.4.2分子與離子的分離篩選 111.5選題的意義及內(nèi)容 121.5.1選題意義 121.5.2研究?jī)?nèi)容 12二、實(shí)驗(yàn)部分 132.1實(shí)驗(yàn)思路 132.2實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 142.3實(shí)驗(yàn)步驟 152.3.1AAO孔道內(nèi)修飾納米金顆粒的實(shí)驗(yàn)具體步驟 152.3.2改變PDA及HAuCl4濃度，對(duì)AAO孔道金顆粒進(jìn)行調(diào)控的實(shí)驗(yàn)步驟 162.3.3修飾金顆粒的AAO膜特異性修飾修飾疏水及其對(duì)親、疏水分子的分離 162.3.4修飾金顆粒的AAO膜特異性修飾手性分子及其對(duì)牛血清蛋白的分離 18三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 193.1AAO膜孔道內(nèi)修飾金納米顆粒SEM形貌的表征 193.2、不同PDA濃度、HAuCl4濃度對(duì)孔道內(nèi)金顆粒尺寸及密度的影響 203.2.1不同PDA濃度對(duì)金顆粒的尺寸及密度分布的影響 203.2.2、不同HAuCl4濃度對(duì)金顆粒的尺寸及密度分布的影響 213.2.3同時(shí)改變PDA、HAuCl4濃度對(duì)金顆粒的尺寸及密度分布的影響 223.3、AAO孔道內(nèi)選擇性修飾疏水分子的表征及其對(duì)親、疏水分子篩選 233.3.1修飾二十二烷基硫醇的AAO膜的SEM孔道形貌表征 233.3.2修飾二十二烷基硫醇的AAO膜的接觸角表征 243.3.3修飾二十二烷基硫醇的AAO膜對(duì)親、疏水分子篩選 263.4AAO孔道內(nèi)選擇性的修飾手性分子及其對(duì)BSA分子選擇性運(yùn)輸 28總結(jié)與展望 29致謝 30參考文獻(xiàn) 31

第一章概述1.1納米孔的概述孔徑介于1-100nm，且大于孔的深度或處于同一數(shù)量級(jí)的孔狀納米結(jié)構(gòu)稱為納米孔。反之，當(dāng)孔深遠(yuǎn)大于孔徑的結(jié)構(gòu)稱為納米通道[1]。納米孔根據(jù)其材料可以分為兩大類：1、生物納米孔；2、固態(tài)納米孔；1.1.1生物納米孔生物納米孔是生物分子中形成的天然納米孔道，如生物膜離子通道、溶血素（α-hemolysin，目前應(yīng)用最為廣泛的生物孔道材料，如圖1所示）跨磷脂雙層細(xì)胞膜形成的離子通道等，是生物體中控制信號(hào)分子[2]、遺傳物質(zhì)以及細(xì)胞或細(xì)胞器內(nèi)外環(huán)境之間能量的運(yùn)輸[3]的重要結(jié)構(gòu)。它們被稱為膜蛋白嵌入細(xì)胞膜內(nèi)，通過各種功能參與生物體的許多的生命過程[4]。作為極其敏感的機(jī)電元件，它們主要通過跨膜離子運(yùn)輸?shù)姆绞絹砭S持生物體的正常生理?xiàng)l件。例如，當(dāng)大腦處于靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)，存在于神經(jīng)細(xì)胞中的配體門控離子通道被關(guān)閉，而當(dāng)特定神經(jīng)遞質(zhì)與通道上的分子識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合時(shí)，它們可被打開以允許特定離子通過。此外，感覺系統(tǒng)中存在的蛋白質(zhì)通道可以直接響應(yīng)特殊分子或物理刺激。例如，香草素受體可以對(duì)外界的刺激進(jìn)行響應(yīng)。這些蛋白質(zhì)納米孔也可以在體外實(shí)現(xiàn)許多重要的功能。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，生物納米孔已被廣泛研究并應(yīng)用。例如，OxfordNanoporeTechnologies已經(jīng)用于一種商業(yè)便攜式設(shè)備，通過蛋白質(zhì)納米孔進(jìn)行分子分析。該裝置適用于分析DNA、RNA、蛋白質(zhì)和小分子，操作簡(jiǎn)單方便，分析效果好。這些蛋白質(zhì)納米孔已得到很好的發(fā)展和總結(jié)[5-7]。然而，生物離子通道必須依賴脆弱的磷脂雙層，具有不穩(wěn)定性，這不可避免地限制了它們?cè)诂F(xiàn)實(shí)世界中大規(guī)模的應(yīng)用。圖1：α-溶血素生物蛋白孔1.1.2固態(tài)納米孔固態(tài)納米孔是在薄膜上人為制造的納米級(jí)孔隙，常用仿生固態(tài)納米孔道根據(jù)材料劃分主要分為有機(jī)孔道、無機(jī)孔道以及復(fù)合孔道[8-9]。如圖2所示。目前，有機(jī)孔道材料應(yīng)用最廣泛的主要是聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（Polyethyleneterephthalate,PET）。采用重離子徑跡刻蝕技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)不同結(jié)構(gòu)、尺寸的PET納米孔道的制備[10-12]。無機(jī)孔道材料主要包括陽極氧化鋁膜（AAO）、氮化硅、玻璃等材料[13-15]。復(fù)合孔道材料是指通過物理化學(xué)技術(shù)，將不同孔道材料結(jié)合在一起形成的一種納米孔道材料。另外，根據(jù)基底膜上納米孔的數(shù)量劃分，分為單納米孔材料（膜上只有一個(gè)孔道）和多納米孔材料（膜上有兩個(gè)或兩個(gè)以上的納米孔道）兩種[11]。與生物納米孔相比，固態(tài)納米孔具有孔徑可調(diào)，機(jī)械強(qiáng)度高，力學(xué)、化學(xué)性能穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)，并且可通過多種制備工藝制得，可以實(shí)現(xiàn)納米孔的大規(guī)模制備與加工。通過改變納米孔大小[16]、表面電荷[17]和極性[18]可改變固態(tài)納米孔的表面與孔道的性質(zhì)，使其具有特異性，可以選擇性地分離篩選與運(yùn)輸物質(zhì)。另外，通過調(diào)節(jié)納米孔的孔徑，可以對(duì)較大的分子和器件進(jìn)行檢測(cè)，例如DNA、DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物等，成為新的納米材料的表征手段。圖2：仿生孔道分類1.2固態(tài)納米孔/納米通道的制備三種常見的固態(tài)孔結(jié)構(gòu)分別是納米孔、納米通道以及納米管，我們使用納米孔/納米通道來代表所有這些類型的固態(tài)孔結(jié)構(gòu)。近年來，由于結(jié)構(gòu)和功能與生物離子通道的相似性，固態(tài)納米孔和納米通道都引起了廣泛的關(guān)注，與生物納米孔相比，固態(tài)納米孔/納米通道具有孔徑可調(diào)，機(jī)械強(qiáng)度高，力學(xué)、化學(xué)性能穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)。所以，科學(xué)家致力于設(shè)計(jì)和構(gòu)建與生物離子通道具有共同特征的固態(tài)納米孔/納米通道。固態(tài)納米孔的常用制備方法包括：1.2.1徑跡刻蝕法徑跡刻蝕法包括兩個(gè)步驟，首先是形成潛徑跡區(qū)。高能離子穿過固體有機(jī)薄膜，將自己的能量傳遞給固體膜中的低能電子，并釋放出二次電子流，二次電子迅速沿著固體膜的徑跡向外擴(kuò)散，使能量逐漸轉(zhuǎn)變成原子的運(yùn)動(dòng)，實(shí)現(xiàn)固體膜的加熱。釋放出的熱量使固體膜形成一個(gè)密度小、化學(xué)活性大的特殊區(qū)域，這個(gè)區(qū)域稱為潛徑跡區(qū)（圖1.12）。其次是化學(xué)刻蝕。在刻蝕前，用365nm/254nm的紫外光輻照具有潛在徑跡的有機(jī)薄膜，正反面各紫外輻照1h，使?jié)搹桔E區(qū)域化學(xué)活性增大，更容易蝕刻。然后，將紫外輻照后的膜與刻蝕液反應(yīng)，由于經(jīng)過高能離子輻射的區(qū)域化學(xué)活性大，刻蝕速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他位置，在一定的條件限制下，該區(qū)域被刻蝕液溶解，其他區(qū)域未被溶解，從而形成特定形狀的孔道。徑跡刻蝕法常用于有機(jī)固態(tài)孔道的制備，例如苯二甲酸乙二醇酯(PET)，聚碳酸酯(PC)，聚酰亞胺(PI)等。目前人們利用并控制不同的刻蝕條件，已經(jīng)得到了各種形狀結(jié)構(gòu)的有機(jī)納米孔道[19]。1.2.2模板法在特定的模板膜上沉積所需要的孔道材料，然后去掉模板，制備所需材料的固體孔的方法稱為模板法。一般模板法所用到的模板主要有：徑跡刻蝕法制備的有機(jī)固態(tài)多孔膜[20]，分子篩[22]，陽極氧化鋁（AAO）多孔膜[21]等。以AAO多孔膜為例，首先將AAO多孔膜為模板，在模板上沉積待成孔的物質(zhì)，成型后，再將表面的沉積物按需要進(jìn)行處理，最后應(yīng)用化學(xué)腐蝕手段去除模板孔道，就可以得到所需材料的納米通道。1.2.3聚焦離子束（FIB）技術(shù)聚焦離子束技術(shù)近20年來發(fā)展起來的新型刻蝕技術(shù)，是用于光刻掩模版修補(bǔ)和集成電路修飾而專門設(shè)計(jì)的一種精細(xì)加工技術(shù)。利用FIB技術(shù)制備納米孔的基本原理是：利用離子束與晶體表面的作用，在離子束聚焦位置刻蝕掉晶體原子或分子，形成納米孔洞。當(dāng)一束具有幾千電子伏特的離子束轟擊材料表面時(shí)，將產(chǎn)生兩種截然不同的效應(yīng)。一種是原子尺寸的沖蝕過程，即瓣射。離子束將材料表面最外層的原子和分子刻蝕掉，形成一個(gè)小洞／小孔，通過該途徑產(chǎn)生的納米孔技術(shù)稱作濺射刻蝕。另一種效應(yīng)是離子束刺激材料表面原子或分子的橫向遷移，沿表面移動(dòng)的原子或分子進(jìn)入已形成的小孔內(nèi)，縮小甚至封閉住小孔。在表面原子或分子橫向遷移的過程中，當(dāng)達(dá)到預(yù)設(shè)納米孔尺寸時(shí)，通過反饋機(jī)理的提示終止此過程。因而，轟擊材料在這兩種效應(yīng)的作用下，產(chǎn)生一定尺寸的納米孔。除了用于硅基材料的刻蝕外，這種技術(shù)還可用于刻蝕Al、Cr、W及聚合物材料，如聚甲基丙稀酸甲酯（PMMA）和聚酷亞胺（PI）等[21]。1.3固態(tài)納米孔/納米通道生物功能化到目前為止，有許多工作已經(jīng)說明了固態(tài)離子納米通道/納米孔的最新發(fā)展，包括多樣的制備方法[23]，功能化[24]，和具體的應(yīng)用[25]。但很少關(guān)注生物分子功能化。近幾年，生物分子及其類似物功能化修飾的固態(tài)離子納米通道/納米孔快速發(fā)展。生物分子具有許多優(yōu)點(diǎn)：（1）核酸堿基互補(bǔ)配對(duì)，生物分子適體/靶標(biāo)，抗原/抗體，酶/反應(yīng)物，生物素/抗生物素蛋白和β-環(huán)糊精/氨基酸的特異性識(shí)別[26]；（2）對(duì)外界刺激的特異性反應(yīng)[27]（如構(gòu)象或電荷狀態(tài)隨pH值、金屬/重金屬離子、光和氧含量等變化而變化）；（3）結(jié)構(gòu)擴(kuò)增[28]；（4）高效酶促反應(yīng)[29]。同時(shí)，固態(tài)納米通道/納米孔系統(tǒng)是有利的平臺(tái)。第一，它們可以改變離子電流作為監(jiān)測(cè)生物反應(yīng)例如：特殊識(shí)別，外部刺激反應(yīng)等的信號(hào)[30]。其次，納米通道/納米孔為納米尺度的功能分子和分析物之間的相互作用提供了一個(gè)限制的區(qū)域[31]，這導(dǎo)致在納米通道/納米孔中產(chǎn)生了反應(yīng)物容易和頻繁傳輸?shù)膭?dòng)力學(xué)效應(yīng)，提高了反應(yīng)常數(shù)。當(dāng)固態(tài)納米通道/納米孔被生物分子功能化后，在實(shí)際應(yīng)用中有兩個(gè)主要特征[32]：特異性和信號(hào)放大，這是由于生物分子的優(yōu)勢(shì)和固態(tài)離子納米通道/納米孔的特性的結(jié)合，這兩個(gè)特征與高度特異性和敏感性傳感[33]，仿生運(yùn)輸[34]，和能量轉(zhuǎn)換的應(yīng)用有關(guān)。當(dāng)納米通道/納米孔用生物分子功能化時(shí)，對(duì)于實(shí)現(xiàn)以上提到的功能的相關(guān)技術(shù)是十分重要的。這些技術(shù)涉及界面化學(xué)的許多基本機(jī)制，基本包括三種方式：（1）直接鍵合。根據(jù)生物分子官能團(tuán)的不同，所選納米通道/納米孔材料（如聚合物，陽極氧化鋁和玻璃）性質(zhì)的差異，以及修飾功能分子方法的不同，采用傳統(tǒng)的兩步/三步法或改進(jìn)版本。（2）間接鍵合。納米通道/納米孔的原始表面被新物質(zhì)（例如Au）覆蓋，然后在新產(chǎn)生的界面上進(jìn)行功能化修飾。（3）非鍵合。通過靜電作用將生物分子引入納米通道/納米孔或者甚至直接注入孔道內(nèi)。本論文中使用的是陽極氧化鋁（AAO）無機(jī)膜，在AAO內(nèi)壁修飾金納米顆粒，主要采用的第二種方式。間接鍵合首先是覆蓋納米通道/納米孔的原始官能團(tuán)，并且隨后在新產(chǎn)生的表面上進(jìn)行生物分子的功能化。常見的間接鍵合是將Au固定在納米孔/納米通道的外表面或內(nèi)壁，由于Au與巰基（-SH）可形成Au-S鍵[35]，因此，可以將含有巰基的生物分子固定在納米通道/納米孔外表面或內(nèi)壁上。通常，通過濺射或電化學(xué)方法沉積Au層。此外，利用聚多巴胺修飾納米孔/納米通道的外表面或內(nèi)壁是另一種常見的間接鍵合方式。通過真空抽濾或浸泡等方式，將聚多巴胺（PDA）覆蓋在納米通道/納米孔的原始化學(xué)表面上，由于聚多巴胺具有強(qiáng)的粘附性且存在許多官能團(tuán)，例如兒茶酚，亞胺和胺等，其對(duì)于修飾特定的生物分子是十分重要的。PDA層還可以通過原位還原HAuCl4誘導(dǎo)Au納米顆粒的形成，使納米孔金屬化，進(jìn)而利用Au-S鍵使Au粒子表面官能化。1.4智能固態(tài)納米孔/納米通道的應(yīng)用當(dāng)溶液中的生物分子通過納米孔/納米通道，或生物分子固定于納米孔/納米通道時(shí)，在一定濃度的電解質(zhì)溶液中，會(huì)有兩種效應(yīng)產(chǎn)生：靜電效應(yīng)[37]和空間位阻效應(yīng)[38]。靜電效應(yīng)是對(duì)于荷電生物分子而言，當(dāng)荷電生物分子通過特異性識(shí)別或共價(jià)鍵合于納米孔壁時(shí)，會(huì)引起表面電荷密度或電荷性質(zhì)的改變。此時(shí)，納米孔壁與傳輸離子之間的相互作用也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化從而改變納米孔中離子傳輸速率。空間位阻效應(yīng)是對(duì)尺寸比較大的分子而言，當(dāng)足夠大的生物分子引入納米孔／納米通道后，會(huì)阻塞納米孔／納米通道，從而導(dǎo)致離子自由輸運(yùn)空間和輸運(yùn)量的減小。當(dāng)采用一定的檢測(cè)手段時(shí)，所檢測(cè)到的離子傳輸量的變化可以間接對(duì)納米空腔內(nèi)固定的生物分子進(jìn)行定性和定量分析。因此，納米孔中的很多傳感應(yīng)用都是基于這兩種效應(yīng)發(fā)展起來的[39]。綜上所述，納米孔／通道材料的應(yīng)用研究主要包括以下幾個(gè)方面：1.4.1、能量轉(zhuǎn)換能源的開發(fā)與利用是人類社會(huì)發(fā)展的基礎(chǔ)。當(dāng)今世界，不可再生能源的儲(chǔ)量急劇下降，能源危機(jī)是當(dāng)今世界面臨的一大難題。為了解決這個(gè)問題，我們必須開發(fā)利用可再生能源及尋找能源轉(zhuǎn)換的新方法。近年來，受生物離子通道的啟發(fā)，仿生固態(tài)納米孔/通道技術(shù)得到迅猛的發(fā)展，也為能量轉(zhuǎn)換器件的小型化提供了基礎(chǔ)[40,41]。基于納米孔道的能源轉(zhuǎn)換方法是利用納米孔道在納米尺度上特有的物理化學(xué)性質(zhì)，將環(huán)境中存在的清潔能源轉(zhuǎn)換為電能。與傳統(tǒng)的發(fā)電與能量轉(zhuǎn)換設(shè)備相比，它不需要機(jī)械轉(zhuǎn)動(dòng)裝置，減少了驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)動(dòng)裝置的能量消耗，同時(shí)也為電源部件的小型化和集成化提供了新思路?；诩{米孔道的能量的轉(zhuǎn)換體系分為三類：1）基于納米孔道的機(jī)械能-電能轉(zhuǎn)換將孔道表面帶有凈余電荷的納米孔置于電解質(zhì)溶液時(shí)，會(huì)在溶液層中形成靜電場(chǎng),使溶液中的反離子聚集在表面附近形成一個(gè)離子分布。在有限區(qū)域內(nèi),例如微納孔道內(nèi),這樣的兩層不同帶電的區(qū)域形成表面雙電荷層，通過外部機(jī)械壓力將電解質(zhì)溶液推過納米孔道，使得電解質(zhì)溶液在通過孔道內(nèi)表面附近雙電荷層時(shí)發(fā)生電荷分離，從而產(chǎn)生動(dòng)電流和動(dòng)電勢(shì)。基于這種孔道雙電荷層的機(jī)電轉(zhuǎn)換思路最早在20世紀(jì)60年代被提出[42]。與傳統(tǒng)的發(fā)電機(jī)相比，納米流體發(fā)電裝置的設(shè)備簡(jiǎn)單，只需要納米孔道，電解質(zhì)溶液，以及一定的壓力差三個(gè)條件就能夠?qū)崿F(xiàn)機(jī)-電能量間的轉(zhuǎn)換，減小了驅(qū)動(dòng)機(jī)械設(shè)備的能量消耗，提高了能量轉(zhuǎn)化效率。因此近年來，關(guān)于納米流體電池的研究日益熱門。2）基于仿生智能納米孔道的鹽差能轉(zhuǎn)換鹽差能是混合不同的鹽溶液來釋放能量，屬于吉布斯自由能的一種，是清潔可再生能源，對(duì)環(huán)境友好。理論上均勻混合1m3的具有不同鹽濃度的海水和河水,將產(chǎn)生1.7MJ的能量[46]。傳統(tǒng)的方法是通過具有選擇透過性的離子交換膜進(jìn)行海水和淡水的混合,被稱為反向電滲析技術(shù)，這是由Pattle[43]獨(dú)立提出,當(dāng)時(shí)他所得到的功率密度只有0.005mW/cm2，Weinstein和Leitz[44]使用一組交替排列陰離子和陽離子交換膜作為溶液混合膜組,所得到的功率密度仍然僅有0.017mW/cm2，所以此方法得到的功率密度低，難以滿足實(shí)際需要，而且離子交換膜的成本昂貴，壽命短，限制了這種技術(shù)的發(fā)展。受到生物離子通道可以高效率地產(chǎn)生和積累來自環(huán)境中的能源,實(shí)現(xiàn)能量的轉(zhuǎn)換、存儲(chǔ)與利用的啟發(fā)，科學(xué)家開始用具有規(guī)則形狀及電荷選擇性的固態(tài)納米孔代替了離子交換膜，用反向電滲析的方法將鹽差能轉(zhuǎn)換為電能稱為納流體反向電滲析[45]。郭維等[46]在實(shí)驗(yàn)上得到的單納米孔道的能量輸出功率達(dá)到26pW,當(dāng)孔密度達(dá)到108~1010/cm2時(shí)，功率密度可以達(dá)到3~260mW/cm2,比現(xiàn)有使用離子交換膜材料的反向電滲析體系高出了2~4個(gè)數(shù)量級(jí)。之所以能夠很大程度上提高反滲透體系的工作效率，主要原因在于直通的納米孔道大大降低了通道對(duì)電解質(zhì)流體的流阻,從而提高了單位時(shí)間通過孔道的離子通量,提高了功率密度。固態(tài)納米通道制備簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，為高效的利用鹽差能提供了可能性。3）基于仿生智能納米孔道的能源轉(zhuǎn)換體系細(xì)菌視紫紅質(zhì)，是一種色素蛋白，它具有利用和轉(zhuǎn)換光能的能力。在太陽光驅(qū)動(dòng)下，它能夠通過一系列的跨膜質(zhì)子泵和質(zhì)子通道將光能轉(zhuǎn)換成為光電流。在這個(gè)過程中，離子通道具有十分重要的作用。受此啟發(fā)，郭維等[45]將光酸分子引入到含有仿生質(zhì)子通道的特殊設(shè)計(jì)的光電化學(xué)池中,通過對(duì)納米通道構(gòu)型和表面電荷的調(diào)控，成功的將光能轉(zhuǎn)化為了電能。但目前轉(zhuǎn)換效率太低，還需要進(jìn)一步研究。ATP-酶（又稱三磷酸腺苷酶）廣泛存在于體內(nèi)，它能夠?qū)TP水解為ADP與磷酸根離子并釋放能量，為生物的生命活動(dòng)提供能量。受此啟發(fā)，科學(xué)家模仿植物光合作用，通過將ATP-酶在聚合物多孔膜一側(cè)上的組裝，使得膜兩端的質(zhì)子濃度不同造成質(zhì)子的流動(dòng)，將光能轉(zhuǎn)換為化學(xué)能[47]。1.4.2分子與離子的分離篩選納米通道對(duì)分子和離子的分離篩選是由分子與離子的特性以及納米通道內(nèi)表面的性質(zhì)決定的。根據(jù)分子與離子的尺寸大小、親疏水性能、帶電荷情況、特異性等特性的不同，可通過調(diào)整納米通道的孔徑、修飾親疏水分子、修飾帶電分子，特異性識(shí)別分子等方法實(shí)現(xiàn)不同分子通過納米孔的難易程度不同，從而達(dá)到目標(biāo)分子、離子分離的目的。Martin小組采用0.6nm金納米管膜對(duì)大分子釕聯(lián)吡啶Ru(bpy)32+及小分子甲基紫精MV2+在納米管內(nèi)的遷移行為進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)小分子MV2+很快的通過了納米管膜，而大分子兩周都無法通過金納米管膜，從而實(shí)現(xiàn)了基于分子尺寸大小的完全分離[48]。Jirage等[49]將孔徑小于1nm的納米通道膜置于U型池中間，把分子量為79的吡啶和分子量為24的喹啉放在滲透池中，通過吸光度變化觀察接收池中兩種分子數(shù)量的變化。結(jié)果表明，只有體積較小的吡啶分子透過納米通道膜進(jìn)入接收池中，而體積較大的喹啉分子卻沒有透過納米通道膜，從而實(shí)現(xiàn)將大小分子分離。Lee等通過調(diào)控陰離子表面活性劑在金納米管壁的吸附，從而調(diào)控納米管壁的親疏水性質(zhì)，建立了基于電位調(diào)控不同親疏水性質(zhì)的離子選擇性傳輸?shù)姆椒╗50],Lee等通過硫醇化學(xué)將兩性分子L-半胱氨酸固定于金納米管的內(nèi)壁，通過調(diào)控pH來改變納米管中L-半胱氨酸的荷電性質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)pH調(diào)控納米管內(nèi)不同荷電離子的選擇性傳輸[51]。Martin等[52]將乙醇脫氫酶固定在聚碳酸酯膜納米通道內(nèi)，這種酶對(duì)苯丙氨酸具有識(shí)別能力，可以將D型和L型苯丙氨酸分離開來。并且證明納米通道的內(nèi)徑越小，分離系數(shù)越高，當(dāng)納米通道為30nm時(shí)，分離系數(shù)高達(dá)4.9。1.5選題的意義及內(nèi)容1.5.1選題意義生物納米通道廣泛存在于生物體的膜結(jié)構(gòu)中，對(duì)于生物體的物質(zhì)傳輸、能量傳輸、信號(hào)傳遞等生命活動(dòng)起著至關(guān)重要的作用,并且生物納米孔道具有特異性與選擇性等優(yōu)點(diǎn)，可以應(yīng)用于分子分離篩選等方面，然而它必須依賴于磷脂雙分子層才能發(fā)揮作用，穩(wěn)定性差，而且它的孔徑固定。因此限制了它在外在環(huán)境中的應(yīng)用。近十幾年來，受生物納米通道的的啟發(fā)，固態(tài)納米孔/納米通道技術(shù)逐漸發(fā)展起來。相比于生物納米通道，其具有孔徑可調(diào)、結(jié)構(gòu)堅(jiān)固穩(wěn)定、物理性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。而且固態(tài)納米孔/納米通道可通過功能化修飾很大程度上模仿生物納米通道，為研究生物納米通道提供了新的思路。目前，仿生固態(tài)納米孔/通道能夠較好的分離篩選分子量差別大、帶電荷情況不同的分子與離子，但對(duì)于分子量接近，帶電荷情況相似的分子與離子的分離篩選效果不理想，在此背景下，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)AAO進(jìn)行功能化修飾，建立一個(gè)以AAO為模板的分子分離篩選體系。旨在通過在孔道內(nèi)修飾不同的功能分子對(duì)分子量接近、帶電荷情況相似的，但親、疏水性能不同或手性分子進(jìn)行分離篩選1.5.2研究?jī)?nèi)容本論文主要通過對(duì)納米孔的分類，固態(tài)納米孔/納米通道的制備方法、生物功能化及應(yīng)用幾個(gè)方面對(duì)納米孔進(jìn)行了綜述，并探究了無機(jī)納米孔AAO通過功能化修飾對(duì)分子分離篩選的作用。實(shí)驗(yàn)的主要內(nèi)容包括以下三個(gè)方面：1.選取陽極氧化鋁模板（AAO,孔徑80-100nm）作為基底，利用聚多巴胺（PDA）溶液的粘附性與強(qiáng)還原性（將氯金酸（HAuCl4）中Au3+還原為Au），在AAO孔道的內(nèi)壁上修飾金納米顆粒。2.通過改變PDA濃度、HAuCl4濃度及兩者同時(shí)改變對(duì)AAO孔道內(nèi)金納米顆粒的分布密度、尺寸大小進(jìn)行有效的調(diào)控，旨在AAO膜孔道內(nèi)修飾密度高、粒徑大的金納米顆粒。3.Au可與巰基形成穩(wěn)定的Au-S鍵，在修飾有金顆粒的AAO孔道內(nèi)選擇性的修飾帶巰基的功能分子，通過修飾疏水分子二十二烷基硫醇，探究其對(duì)電荷相同、尺寸類似的親、疏水分子的篩選；通過修飾手性分子（L-半胱氨酸與D-半胱氨酸）探究其對(duì)牛血清蛋白(BSA)的選擇性運(yùn)輸。二、實(shí)驗(yàn)部分2.1實(shí)驗(yàn)思路利用聚多巴胺（PDA）溶液具有強(qiáng)粘附性與強(qiáng)還原性，通過簡(jiǎn)單的真空抽濾的方法，將PDA抽濾通過陽極氧化鋁（AAO）的孔道，使其在AAO內(nèi)壁上形成一層薄膜。然后將此AAO膜浸泡在氯金酸（HAuCl4）溶液中，由于HAuCl4中的Au3+具有強(qiáng)氧化性，PDA可以將其還原為Au原子，并粘附在AAO膜的內(nèi)壁，大量的金原子聚集在一起就形成了納米金顆粒（如圖2.1）。這樣就可以在AAO膜的孔道內(nèi)修飾上分散性的金納米顆粒。我們通過改變PDA濃度與HAuCl4濃度等條件，實(shí)現(xiàn)了對(duì)孔道內(nèi)的金納米顆粒尺寸大小、分布密度的調(diào)控。而且金顆粒的表面與AAO內(nèi)壁的表面性質(zhì)差別很大，AAO膜內(nèi)壁修飾金納米顆粒后，就產(chǎn)生了性質(zhì)迥異的兩個(gè)界面,進(jìn)一步還原了生物通道不同區(qū)域?qū)崿F(xiàn)不同功能的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，為修飾不同的生物分子提供了可能。為探究AAO膜納米孔在分子分離篩選的應(yīng)用，本實(shí)驗(yàn)利用金原子與巰基反應(yīng)形成穩(wěn)定的Au-S鍵的原理，一方面，在修飾完納米金顆粒的AAO膜中選擇性的修飾上帶巰基的疏水分子，在電化學(xué)的驅(qū)動(dòng)下，檢測(cè)其對(duì)疏水分子及親水分子的通過情況。另一方面，在修飾完納米金顆粒的AAO膜中選擇性的修飾上帶巰基的手性分子，在電化學(xué)驅(qū)動(dòng)下，檢測(cè)其對(duì)牛血清蛋白（BSA）的通過情況。圖2.1AAO孔道內(nèi)金顆粒的生長(zhǎng)機(jī)理圖2.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器本實(shí)驗(yàn)所用到的相關(guān)實(shí)驗(yàn)藥品如下表1所示，實(shí)驗(yàn)儀器如表2所示表2.1實(shí)驗(yàn)所用的相關(guān)試劑信息名稱純度/規(guī)格生產(chǎn)廠家亞甲基藍(lán)，三水98%國(guó)藥集團(tuán)二十二烷基硫醇>98%東京化成工業(yè)株式會(huì)社阿米替林鹽酸鹽98%薩恩化學(xué)有限公司氯化鉀>99.8%國(guó)藥集團(tuán)陽極氧化鋁模板孔徑80-100nm合肥普元納米科技有限公司37%濃鹽酸AR國(guó)藥集團(tuán)氯金酸99%SigmaAldrich多巴胺鹽酸鹽99%AlfaAesar十二水合磷酸一氫鈉AR國(guó)藥集團(tuán)二水合磷酸氫二鈉AR國(guó)藥集團(tuán)牛血清蛋白2mg/mL生工生物工程股份有兩公司L/D-半胱氨酸98%北京百靈威科技有限公司表2.2實(shí)驗(yàn)所用到的相關(guān)實(shí)驗(yàn)儀器信息儀器名稱儀器型號(hào)生產(chǎn)廠家超聲波清潔機(jī)SB.120DT寧波新芝生物科技股份有限公司分析天平AL204電子天平梅特勒-托利多儀(上海)有限公司掃描電子顯微鏡SU8010株式會(huì)社日立制作所電化學(xué)工作站CHI660E上海振華科技有限公司循環(huán)水式真空泵SHZ-D(Ⅲ)武漢科爾儀器設(shè)備有限公司移液槍GE29721GILSON電熱鼓風(fēng)干燥箱DHG-9030A上海一恒科學(xué)儀器有限公司水浴鍋HH-1數(shù)顯恒溫水槽榮華儀器制造有限公司超純水儀NWUltra-pureWaterSystemHealForce接觸角測(cè)試儀DSA-100KRUSS熒光光譜儀FS5英國(guó)愛丁堡儀器公司2.3實(shí)驗(yàn)步驟2.3.1AAO孔道內(nèi)修飾納米金顆粒的實(shí)驗(yàn)具體步驟：（1）V37%HCl:VH2O=1:2的鹽酸溶液的配制：用膠頭滴管取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37%的濃鹽酸1.5mL于5mL試管中，用移液槍移取3mL去離子水混合均勻待用；（2）AAO膜的預(yù)處理：將AAO膜浸泡在（1）中的鹽酸溶液中，每片約0.5mL。然后超聲處理2min,用去離子水沖洗AAO膜表面；（3）1mMHAuCl4溶液的配制與預(yù)熱：用200μL移液槍移取80μL50mMHAuCl4于試管中，加入3.92mL去離子水，混合均勻。用錫箔紙包好，置于35℃水浴鍋中預(yù)熱30min；（4）2mg/mL的PDA溶液的配制：用分析天平準(zhǔn)確稱取60mg多巴胺固體，加入12mL去離子水震蕩混合均勻；（5）真空抽濾裝置的搭建：將一張濾膜放在抽濾漏斗上，用水將濾紙浸潤(rùn)，通過用鑷子移動(dòng)濾紙的位置除去濾紙與漏斗間的氣泡；（6）AAO膜的抽洗及多巴胺溶液的抽濾：將AAO膜置于濾膜上，加水浸沒膜表面，打開真空泵開關(guān)，用鑷子輕輕觸碰膜邊緣，檢查膜是否吸緊。用移液槍滴加約50μL的去離子水于膜表面，反復(fù)抽洗5次。然后將（4）中的多巴胺溶液加在膜上，每片膜加1.5mL（大約滴加30次）；（7）PDA與HAuCl4的氧化還原反應(yīng)：將抽濾完多巴胺溶液的AAO膜置于2mL離心管，加入（3）中的氯金酸溶液（每片0.5mL）。然后用錫紙包好，超聲5min，置于35℃的水浴鍋中反應(yīng)2h；（8）修飾后AAO膜的洗滌與烘干：取出反應(yīng)完的AAO膜（顏色為暗紅色），用去離子水沖洗表面，然后在用去離子水抽洗10次以除去表面和孔道內(nèi)殘留的溶液。將抽洗之后的AAO膜置于120℃烘箱內(nèi)恒溫1.5h烘干；（9）利用掃描電鏡對(duì)AAO膜孔道內(nèi)金顆粒尺寸及密度進(jìn)行表征：將制好的AAO膜切開以露出截面，用導(dǎo)電膠將切開的AAO垂直粘在樣品臺(tái)上，噴碳，然后送入樣品室中，調(diào)節(jié)粗調(diào)、細(xì)調(diào)旋鈕聚焦，找到并放大樣品，觀察金納米顆粒的生長(zhǎng)情況，從而對(duì)孔道內(nèi)金顆粒的尺寸及大小進(jìn)行分析；2.3.2改變PDA及HAuCl4濃度，對(duì)AAO孔道金顆粒進(jìn)行調(diào)控的實(shí)驗(yàn)步驟（1）一系列濃度的PDA溶液的配制：分別稱取0.8mg、8mg、20mg、80mg的多巴胺鹽酸鹽固體，加入4mL去離子水溶解，配制成0.2mg/mL、2mg/mL、5mg/mL、20mg/mL四種濃度的多巴胺溶液；（2）一系列濃度的HAuCl4溶液的配制：分別取8μL、80μL、160μL、800μL的50mMHAuCl4原溶液，加入去離子水稀釋至4mL,配置成0.1mM、1mM、2mM、10mM四種濃度的HAuCl4溶液；（3）孔道內(nèi)金納米顆粒尺寸及密度的調(diào)控：通過改變1中（3）（4）步驟中的PDA及HAuCl4的濃度（本實(shí)驗(yàn)調(diào)節(jié)多巴胺濃度與氯金酸為：2mg/mL+0.1mM、2mg/mL+1mM、2mg/mL+10mM、0.2mg/mL+1mM、20mg/mL+1mM、5mg/mL+2mm六組），其他實(shí)驗(yàn)步驟不變，重復(fù)1過程，從而探究PDA濃度與HAuCl4濃度對(duì)金顆粒生長(zhǎng)的影響，找出金顆粒生長(zhǎng)尺寸大，密度大的最佳濃度。2.3.3修飾金顆粒的AAO膜特異性修飾修飾疏水及其對(duì)親、疏水分子的分離（1）阿米替林鹽酸鹽（疏水分子）濃度曲線的滴定：分別配制10-2、10-3、8·10-4、5·10-4、4·10-4、2·10-4、10-4、5·10-5、2·10-5、10-5、5·10-6、10-6mol/L一系列濃度的阿米替林溶液（溶劑為0.1mol/L氯化鉀溶液），通過紫外分光光度計(jì)測(cè)出每個(gè)濃度吸收值，用origin做出濃度-吸收值曲線；（2）亞甲基藍(lán)（親水分子）濃度曲線的滴定：分別配制10-2、10-4、5·10-5、10-5、5·10-6、10-6mol/L一系列濃度的亞甲基藍(lán)溶液（溶劑為0.1mol/L氯化鉀溶液），通過紫外分光光度計(jì)測(cè)出每個(gè)濃度吸收值，用origin做出其濃度-吸收值曲線；（3）1mM的二十二烷基硫醇（C22H46S，疏水分子）溶液的配制：稱取3.42mg的C22H46S固體，加入10mL無水乙醇，用封口膜封住管口，超聲15min至完全溶解；（4）AAO孔道內(nèi)特異性修飾二十二烷基硫醇分子：將修飾有金納米顆粒的AAO膜浸沒于（3）中配好的溶液（每片約0.5mL）,用錫箔紙包好，反應(yīng)過夜；第二天取出，用去離子水沖洗幾次，除去表面的殘留溶液；（5）修飾二十二烷基硫醇分子的AAO膜的接觸角表征：?。?）制備的修飾二十二烷基硫醇分子的AAO膜置于潔凈的玻璃片上，用移液槍滴加一滴去離子水（6μL）于膜上，固定玻璃片于KRUSSDSA-100接觸角測(cè)量?jī)x樣品臺(tái)上，測(cè)定接觸角，取0s、30s、60s、120s、300s與600s為時(shí)間點(diǎn)，記錄接觸角隨時(shí)間變化的規(guī)律。取AAO空白膜、修飾金顆粒的AAO膜做對(duì)比實(shí)驗(yàn)。（6）修飾二十二烷基硫醇分子的AAO膜的SEM表征：將（5）中的膜切開以露出截面，用導(dǎo)電膠將切開的膜垂直粘在樣品臺(tái)上，噴碳，送入樣品室中，調(diào)節(jié)粗調(diào)、細(xì)調(diào)旋鈕聚焦，找到并放大樣品，觀察孔道內(nèi)的結(jié)構(gòu)特征。并取AAO空白膜、修飾金顆粒的AAO膜做對(duì)比實(shí)驗(yàn)。（7）親、疏水分子的跨膜電化學(xué)驅(qū)動(dòng)：親、疏水分子的跨膜電化學(xué)驅(qū)動(dòng)的裝置如下圖2.1所示，其中電解液為0.1mol/L氯化鉀溶液，右側(cè)驅(qū)動(dòng)原液為10-2mol/L阿米替林溶液或亞甲基藍(lán)溶液，驅(qū)動(dòng)時(shí)所用的膜為修飾有二十二烷基硫醇的AAO膜，電極為鉑電極，驅(qū)動(dòng)電壓為+2V，驅(qū)動(dòng)時(shí)間40min，驅(qū)動(dòng)完成后取出左側(cè)驅(qū)動(dòng)液保存。將親、疏水分子通過AAO空白膜、修飾有金顆粒的AAO膜的跨膜電化學(xué)驅(qū)動(dòng)作為對(duì)比實(shí)驗(yàn)；（8）驅(qū)動(dòng)液濃度的確定：將親、疏水分子通過修飾有二十二烷基硫醇的AAO膜、空白AAO膜、修飾有金顆粒的AAO膜所得到的三種驅(qū)動(dòng)液進(jìn)行紫外吸收值測(cè)定，根據(jù)（1）（2）所得到的濃度曲線，將驅(qū)動(dòng)液的紫外吸收值帶入，算出每個(gè)驅(qū)動(dòng)液的濃度；2.3.4修飾金顆粒的AAO膜特異性修飾手性分子及其對(duì)牛血清蛋白的分離（1）1mM的D-半胱氨酸與L-半胱氨酸溶液的配制：用分析天平分別稱取1.2116mg的D-半胱氨酸與L-半胱氨酸于15mL離心管中，然后用移液槍移取10mL的去離子水，震蕩溶解。其中D-半胱氨酸不易溶于水，需超聲15min；（2）修飾金顆粒的AAO膜孔道內(nèi)分別特異性的修飾D-半胱氨酸與L-半胱氨酸：將修飾有金納米顆粒的AAO膜浸沒于（1）中配好的溶液（每片約0.5mL）中，用錫箔紙包好，反應(yīng)過夜。第二天取出，用去離子水沖洗幾次，除去表面的殘留溶液；再用去離子水真空抽洗5次；（3）0.05mol/LPH=7.4的PBS緩沖液的配制：用分析天平稱取十二水合磷酸一氫鈉（Na2HPO4）0.35814g，二水合磷酸氫二鈉（NaH2PO4）0.078g，然后分別用20mL、10mL去離子水溶解。將兩者以4:1的配比(取Na2HPO4溶液16mL，NaH2PO4溶液4mL)混合均勻，現(xiàn)配現(xiàn)用；（4）100nmol/L的帶FITC熒光素BSA溶液的配制：用移液槍取2mg/mL的BSA原溶液17μL加入（3）中所配的PBS溶液5.083mL，震蕩均勻；（5）BSA濃度曲線的滴定：?。?）中100nmol/LBSA溶液，加pH=7.4的PBS溶液稀釋至50、25、10、5與1nmol/L五個(gè)濃度,然后用熒光光譜儀測(cè)出每個(gè)濃度下對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度(其中激發(fā)波長(zhǎng)為494nm,發(fā)射波長(zhǎng)為521nm,狹縫寬度為5mm),測(cè)完每個(gè)濃度之后必須將裝液體的池子用去離子水洗凈吹干，才能進(jìn)行下一次測(cè)量，之后用origin做出濃度-熒光強(qiáng)度曲線。（5）BSA分子的跨膜電化學(xué)驅(qū)動(dòng)：BSA分子的跨膜電化學(xué)驅(qū)動(dòng)的裝置與3.1（8）中相同，但其中電解液為pH=7.4的PBS緩沖液，右側(cè)驅(qū)動(dòng)原液為100nmol/LBSA溶液，驅(qū)動(dòng)時(shí)所用的膜為修飾D-半胱氨酸與L-半胱氨酸的AAO膜，其他條件相同。將BSA分子通過AAO空白膜、修飾有金顆粒的AAO膜的跨膜電化學(xué)驅(qū)動(dòng)作為對(duì)比實(shí)驗(yàn)；（7）驅(qū)動(dòng)液熒光強(qiáng)度的測(cè)定：測(cè)定BSA分子通過修飾有D-半胱氨酸與L-半胱氨酸的AAO膜、空白AAO膜、修飾有金顆粒的AAO膜所得到的四種驅(qū)動(dòng)液熒光強(qiáng)度，分析修飾D-半胱氨酸與L-半胱氨酸的AAO膜對(duì)BSA分子的運(yùn)輸影響；三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論3.1AAO膜孔道內(nèi)修飾金納米顆粒SEM形貌的表征聚多巴胺（PDA）是具有強(qiáng)粘附性與還原性的物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)通過簡(jiǎn)單的真空抽濾的方法，將聚多巴胺附著在AAO孔道內(nèi)，形成一層薄層。然后利用聚多巴胺的還原性將HAuCl4中的Au3+還原為Au原子，在AAO孔道內(nèi)聚集形成金顆粒。并且通過掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)修飾金顆粒的AAO膜表面及孔道內(nèi)的形貌進(jìn)行了表征。SEM結(jié)果如下圖3.1所示，AAO膜外表面基本沒有金納米顆粒，金納米顆粒僅存在于孔道內(nèi)部。修飾了金顆粒的AAO膜表面基本沒有出現(xiàn)堵塞的情況，而呈現(xiàn)“開通”狀態(tài)，證明修飾金顆粒并不會(huì)造成AAO表面堵塞，從而排除了表面形貌改變對(duì)修飾金顆粒的影響。在AAO孔道內(nèi)，可以看出金納米顆粒大多呈球粒狀分散的分布在孔道內(nèi)壁，且直徑都略小于孔徑，說明孔并未被完全的堵塞,由圖3.1（C）可以看出金顆粒外有一層薄膜包附著，這層薄膜可能是PDA薄層。圖3.1（A）金納米顆粒修飾的AAO模板的頂部SEM圖（B）金納米顆粒修飾的AAO模板的底部SEM圖（C）金納米顆粒修飾的AAO模板的截面SEM圖（白點(diǎn)為納米金顆粒）3.2、不同PDA濃度、HAuCl4濃度對(duì)孔道內(nèi)金顆粒尺寸及密度的影響3.2.1不同PDA濃度對(duì)金顆粒的尺寸及密度分布的影響PDA作為將Au3+還原為Au原子的還原劑，其濃度勢(shì)必會(huì)影響孔道內(nèi)金顆粒的生長(zhǎng)尺寸與密度。為研究其影響，如實(shí)驗(yàn)操作2所示，本實(shí)驗(yàn)中選用濃度分別為2、20mg/mL的2種PDA溶液完成AAO膜孔道內(nèi)金納米顆粒的修飾，通過掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)修飾后的AAO膜孔道內(nèi)進(jìn)行表征，本工作中利用“NanoMeasurer”軟件對(duì)孔道內(nèi)金顆粒的尺寸及數(shù)量進(jìn)行整體的統(tǒng)計(jì)。結(jié)果如下圖3.2所示，一方面，隨著PDA濃度從2mg/mL升高到20mg/mL，每個(gè)濃度下的SEM圖片（表面積約為1.1·10-10·m-2）中金顆粒的平均數(shù)目分別為209和417個(gè)，對(duì)應(yīng)的密度為1.9·1012和3.79·1012m-2提高了將近2倍，這由于PDA濃度升高，附著在AAO孔道內(nèi)的PDA分子越多，從而還原產(chǎn)物金顆粒就越多。另一方面，隨著PDA濃度從2mg/mL升高到20mg/mL，金顆粒的尺寸分別為41.7和34.4nm，呈下降的趨勢(shì)。這是因?yàn)殡S著PDA濃度增加，還原劑的數(shù)量增加，所生成的金晶核增加，但HAuCl4中Au3+的濃度固定，所以導(dǎo)致金顆粒的尺寸下降。圖3.2（A-B）PDA濃度分別為2mg/mL（A），20mg/mL（B）所對(duì)應(yīng)的AAO膜孔道內(nèi)金顆粒（AuNPs）分布的SEM圖（C-D）PDA濃度分別為2mg/mL（C），20mg/mL（D）所對(duì)應(yīng)的AuNPs尺寸分布圖（E）金顆粒（AuNPs）尺寸及數(shù)目隨PDA濃度變化統(tǒng)計(jì)表3.2.2不同HAuCl4濃度對(duì)金顆粒的尺寸及密度分布的影響為研究HAuCl4濃度對(duì)AAO膜孔道內(nèi)金納米顆粒生長(zhǎng)尺寸及密度的影響，如實(shí)驗(yàn)操作2所示，本實(shí)驗(yàn)固定PDA濃度為2mg/mL，選用濃度分別為0.1mM、1mM、10mM的三種HAuCl4溶液完成AAO膜孔道內(nèi)金納米顆粒的修飾，并將修飾金顆粒的AAO膜在掃描電子顯微鏡（SEM）下進(jìn)行金顆粒尺寸及分布密度進(jìn)行表征，結(jié)果如下圖3.3所示，隨著HAuCl4濃度由0.1mM上升到10mM，每個(gè)濃度下的金顆粒數(shù)目為0、219和68個(gè)，對(duì)應(yīng)的密度為0、2·1012與6.2·1011m-2。而每個(gè)濃度下的尺寸為0、41.7和62.3nm，當(dāng)HAuCl4為0.1mM時(shí)，并沒有Au顆粒的形成，這可能是因?yàn)锳u3+的濃度太低，生成的Au原子太少，不足以聚集形成金顆粒。當(dāng)HAuCl4濃度從1mM升至10mM時(shí)金顆粒密度下降了將近三倍，尺寸有明顯增加。這是因?yàn)镻DA濃度一定，還原劑濃度一定，而Au3+的濃度增大，導(dǎo)致金顆粒的密度下降，而粒徑增大。圖3.3（A-C）HAuCl4濃度分別為0.1mM（A）、1mM（B）和10Mm（C）對(duì)應(yīng)的AAO膜孔道SEM圖（D-E）HAuCl4濃度分別為1mM（D）和10mM（E）對(duì)應(yīng)的AuNPs尺寸分布圖（F）AuNPs尺寸及數(shù)目隨HAuCl4濃度變化統(tǒng)計(jì)表3.2.3同時(shí)改變PDA、HAuCl4濃度對(duì)金顆粒的尺寸及密度分布的影響由以上實(shí)驗(yàn)可知，通過增大PDA濃度可以單向的提高AAO孔道內(nèi)金納米顆粒密度。反之，通過增大HAuCl4濃度可以單向的增大金顆粒的尺寸。為能夠雙向的調(diào)控金納米顆粒的尺寸與密度分布，在AAO孔道內(nèi)修飾尺寸大、密度高的金顆粒。本實(shí)驗(yàn)通過同時(shí)改變PDA、HAuCl4濃度為5mg/mL、2mM與PDA、HAuCl4濃度為2mg/mL、1mM對(duì)比，探究其對(duì)金納米顆粒的尺寸與密度分布的影響，從而確定最佳PDA、HAuCl4濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下圖3.4所示，由圖可知，當(dāng)PDA、HAuCl4濃度為2mg/mL、1mM，對(duì)應(yīng)的金顆粒尺寸與密度分別為41.7nm與1.9·1012m-2，當(dāng)PDA、HAuCl4濃度為5mg/mL、2mM時(shí)，對(duì)應(yīng)金顆粒的尺寸與密度分別為51.5nm與2.1·1012m-2，后者條件下的金顆粒尺寸與密度都大于前者，而且密度接近于PDA濃度為20mg/mL對(duì)應(yīng)金顆粒密度，尺寸接近于HAuCl4濃度為10mg/mL對(duì)應(yīng)的金顆粒尺寸，所以將PDA、HAuCl4濃度為5mg/mL、2mM作為本實(shí)驗(yàn)中修飾金顆粒的最佳條件。圖3.4(A)PDA與HAuCl4為5mg/mL與2mM對(duì)應(yīng)的AAO膜孔道SEM圖(B)PDA與HAuCl4為2mg/mL與1mM對(duì)應(yīng)的AAO膜孔道SEM圖(C)PDA與HAuCl4為5mg/mL與2mM對(duì)應(yīng)的AuNPs尺寸分布圖(D)PDA與HAuCl4為2mg/mL與1mM對(duì)應(yīng)的AuNPs尺寸分布圖(E)AuNPs尺寸及數(shù)目隨PDA與HAuCl4濃度變化統(tǒng)計(jì)表3.3、AAO孔道內(nèi)選擇性修飾疏水分子的表征及其對(duì)親、疏水分子篩選本實(shí)驗(yàn)利用金原子與巰基反應(yīng)生成穩(wěn)定Au-S鍵的原理，將帶巰基的二十二烷基硫醇（疏水分子）選擇性的修飾在AAO膜孔道內(nèi)的金顆粒上。并對(duì)其進(jìn)行了接觸角表征以及SEM形貌表征。并通過電化學(xué)驅(qū)動(dòng)的方式，探究修飾疏水分子后的AAO膜對(duì)親、疏水分子的分離篩選作用。3.3.1修飾二十二烷基硫醇的AAO膜的SEM孔道形貌表征實(shí)驗(yàn)通過SEM對(duì)修飾二十二烷基硫醇的AAO孔道及表面形貌進(jìn)行表征，探究修飾二十二烷基硫醇后是否改變膜的孔道及表面的形貌特征。并將AAO空白膜、修飾金顆粒的AAO膜作為對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3.5所示，在修飾金顆粒的AAO膜修飾正二十二硫醇疏水分子并未堵塞AAO膜的表面，而且其孔道內(nèi)金顆粒的分布也與修飾金顆粒的AAO膜相似。說明在修飾金顆粒的AAO膜內(nèi)修飾正二十二硫醇疏水分子并未改變膜表面與孔道內(nèi)的形貌。圖3.5(A)AAO膜孔道修飾金顆粒及二十二烷基硫醇示意圖(B-C)AAO膜表面(B)與孔道(C)SEM圖(D-E)修飾金顆粒的AAO膜表面(D)與孔道(E)SEM圖(F-G)金顆粒上修飾二十二烷基硫醇的AAO膜表面(F)與孔道(G)SEM圖3.3.2修飾二十二烷基硫醇的AAO膜的接觸角表征實(shí)驗(yàn)通過對(duì)修飾二十二烷基硫醇的AAO孔道進(jìn)行接觸角測(cè)試，探究修飾二十二烷基硫醇后的AAO膜表面與孔道內(nèi)的親、疏水性質(zhì)變化。結(jié)果如下圖所示，圖3.7為AAO、AAO-AuNPs、AAO-AuNPs-C22H46S三種膜的接觸角隨時(shí)間變化圖，可以看出，修飾二十二烷基硫醇后，AAO膜表面接觸角變大，說明表面變疏水。根據(jù)圖3.8所示，在修飾金顆粒的AAO膜孔道內(nèi)進(jìn)一步修飾疏水分子二十二烷基硫醇，其接觸角隨時(shí)間的變化率進(jìn)一步減小，當(dāng)外界條件一致時(shí)，水分子難以滲透在金顆粒上修飾了二十二烷基硫醇的AAO孔道，說明由于二十二烷基硫醇的修飾，使得孔道內(nèi)具有疏水性質(zhì)。圖3.7AAO、AAO-AuNPs、AAO-AuNPs-C22H46S三種膜的接觸角隨時(shí)間變化圖圖3.8AAO、AAO-AuNPs、AAO-AuNPs-C22H46S三種膜接觸角歸一化后隨時(shí)間變化曲線3.3.3修飾二十二烷基硫醇的AAO膜對(duì)親、疏水分子篩選本實(shí)驗(yàn)通過電化學(xué)驅(qū)動(dòng)的方法，將親疏水分子溶液作為驅(qū)動(dòng)原液，測(cè)定電化學(xué)驅(qū)動(dòng)后所得的驅(qū)動(dòng)液的紫外吸收峰的吸收值，通過濃度曲線計(jì)算得出親、疏水分子跨膜遷移的濃度，進(jìn)行分析。如下圖3.6所示，對(duì)于親水分子亞甲基藍(lán)，其紫外吸收峰出現(xiàn)在291nm與669nm(本實(shí)驗(yàn)取291nm作為吸收峰波長(zhǎng)),并且濃度與紫外吸收值成正比。當(dāng)將10-2mol/L亞甲基藍(lán)作為原液進(jìn)行驅(qū)動(dòng)時(shí)，通過AAO空白膜的驅(qū)動(dòng)液紫外吸收值平均為3.65，濃度為1.04·10-4mol/L；通過修飾金顆粒AAO膜的驅(qū)動(dòng)液紫外吸收值平均為2.64，濃度為7.57·10-5mol/L；通過修飾二十二烷基硫醇AAO膜的紫外吸收值平均為1.09，濃度為3.22·10-5mol/L。由此可以看出，經(jīng)過電化學(xué)驅(qū)動(dòng)后，親水分子亞甲基藍(lán)在空白AAO膜孔道內(nèi)遷移最快，驅(qū)動(dòng)液濃度最大，在修飾金納米顆粒的AAO膜孔道內(nèi)遷移速度減慢，驅(qū)動(dòng)液濃度隨之下降，在修飾二十二烷基硫醇的AAO膜孔道內(nèi)遷移速度進(jìn)一步降低，驅(qū)動(dòng)液濃度最小。這是由于在空白AAO膜孔道內(nèi)無阻礙，亞甲基藍(lán)分子遷移速度快。而在修飾金顆粒的AAO膜孔道內(nèi)存在金納米顆粒，堵塞了部分孔道，使空間位阻增大，減小了孔道有效內(nèi)徑，阻礙了亞甲基藍(lán)分子的遷移。而在修飾二十二硫醇分子的AAO孔道內(nèi)，二十二硫醇分子造成的孔道內(nèi)的疏水效應(yīng)進(jìn)一步的阻礙亞甲基藍(lán)分子的遷移。圖3.6(A)不同濃度亞甲基藍(lán)溶液對(duì)應(yīng)的紫外吸收曲線(B)亞甲基藍(lán)溶液濃度-紫外吸收值曲線(C)經(jīng)過電化學(xué)驅(qū)動(dòng)后分別通過AAO空白膜、修飾金顆粒AAO膜與修飾二十二烷基硫醇AAO膜對(duì)應(yīng)的驅(qū)動(dòng)液濃度柱狀圖如下圖3.7所示，對(duì)于疏水分子阿米替林鹽酸鹽，其紫外吸收峰出現(xiàn)在239nm，濃度與紫外吸收值成正比。當(dāng)將10-2mol/L的阿米替林鹽酸鹽做為原液進(jìn)行電化學(xué)驅(qū)動(dòng)時(shí),通過AAO空白膜的驅(qū)動(dòng)液紫外吸收值平均為0.82，濃度為6.4·10-5mol/L；通過修飾金顆粒AAO膜的驅(qū)動(dòng)液紫外吸收值平均為0.09，濃度為9.1·10-6mol/L；通過修飾二十二烷基硫醇AAO膜的紫外吸收值平均為0.24，濃度為2.02·10-5mol/L，可以看出，經(jīng)過電化學(xué)驅(qū)動(dòng)后，疏水分子阿米替林在空白AAO膜孔道內(nèi)遷移最快，驅(qū)動(dòng)液濃度最大，在修飾金納米顆粒的AAO膜孔道內(nèi)遷移速度減慢，驅(qū)動(dòng)液濃度隨之下降，在修飾二十二烷基硫醇的AAO膜孔道內(nèi)遷移速度提高，驅(qū)動(dòng)液濃度相應(yīng)增大。這是由于在空白AAO膜孔道內(nèi)無阻礙，亞甲基藍(lán)分子遷移速度快。而在修飾金顆粒的AAO膜孔道內(nèi)存在金納米顆粒，堵塞了部分孔道，使空間位阻增大，減小了孔道有效內(nèi)徑，阻礙了亞甲基藍(lán)分子的遷移。而在修飾二十二硫醇分子的AAO孔道內(nèi)，二十二硫醇分子造成的孔道內(nèi)的疏水效應(yīng)進(jìn)一步的促進(jìn)阿米替林分子的遷移。圖3.7：(A)不同濃度阿米替林溶液對(duì)應(yīng)的紫外吸收曲線(B)阿米替林溶液濃度-紫外吸收值曲線(C)經(jīng)過電化學(xué)驅(qū)動(dòng)后分別通過AAO空白膜、修飾金顆粒AAO膜與修飾二十二烷基硫醇AAO膜對(duì)應(yīng)的驅(qū)動(dòng)液濃度柱狀圖綜上，在修飾金顆粒的AAO膜中修飾疏水分子二十二硫醇后，沒有改變孔道內(nèi)的結(jié)構(gòu)形貌，但使孔道內(nèi)具有疏水的性質(zhì)，并且能夠抑制親水分子亞甲基藍(lán)在孔道內(nèi)遷移，促進(jìn)疏水分子阿米替林的遷移。因此，該體系對(duì)親、疏水分子具有篩選作用。3.4AAO孔道內(nèi)選擇性的修飾手性分子及其對(duì)BSA分子選擇性運(yùn)輸本實(shí)驗(yàn)利用Au原子與巰基結(jié)合形成穩(wěn)定的Au-S鍵的原理，在修飾金顆粒的AAO膜表面分別選擇性的修飾上手性分子D-半胱氨酸與L-半胱氨酸，然后檢測(cè)經(jīng)兩種手性分子修飾后的AAO膜在電化學(xué)驅(qū)動(dòng)下對(duì)BSA跨膜運(yùn)輸?shù)挠绊?。?shí)驗(yàn)測(cè)量BSA通過AAO空白膜、修飾金顆粒的AAO膜、修飾D-半胱氨酸分子的AAO膜與修飾L-半胱氨酸分子的AAO膜后分別所得的驅(qū)動(dòng)液的熒光強(qiáng)度，通過BSA的濃度曲線計(jì)算出驅(qū)動(dòng)液的濃度。本實(shí)驗(yàn)中BSA中的熒光素為FITC，其激發(fā)波長(zhǎng)為494nm,發(fā)射波長(zhǎng)為521nm。結(jié)果如下圖3.8所示，通過修飾Au顆粒的AAO膜的BSA濃度最低，約為5.5nM，這是由于修飾Au顆粒使AAO膜的有效內(nèi)徑減小，空間位阻增大，阻礙了BSA分子的遷移。而進(jìn)一步在修飾金顆粒的AAO膜中修飾上D-半胱氨酸分子與L-半胱氨酸，發(fā)現(xiàn)通過兩種膜的BSA濃度都增大,分別為6.4nM與8nM，其中通過修飾L-半胱氨酸的AAO膜的BSA濃度與通過空白AAO膜的接近。而通過修飾D-半胱氨酸的AAO膜的BSA濃度最高，說明在修飾金顆粒的AAO膜中修飾上D-半胱氨酸與L-半胱氨酸，都能促進(jìn)BSA在孔道內(nèi)的運(yùn)輸，但兩者的促進(jìn)程度不同，D-半胱氨酸的促進(jìn)程度明顯高于L-半胱氨酸。所以在AAO孔道內(nèi)修飾手性分子L/D-半胱氨酸，對(duì)BSA分子的運(yùn)輸展現(xiàn)出手性選擇性，其中修飾D-半胱氨酸的AAO孔道更有利于BSA分子的跨膜運(yùn)輸。圖3.8(A)不同濃度BSA溶液對(duì)應(yīng)的熒光光譜曲線(B)BSA溶液濃度-熒光強(qiáng)度曲線(C)經(jīng)過電化學(xué)驅(qū)動(dòng)后BSA分別通過四種膜對(duì)應(yīng)的驅(qū)動(dòng)液熒光光譜圖(D)經(jīng)過電化學(xué)驅(qū)動(dòng)后BSA分別通過四種膜對(duì)應(yīng)的濃度柱狀總結(jié)與展望生物孔道因其具有高度的選擇性與特異性，被廣泛的應(yīng)用在分子的分離篩選、分子的檢測(cè)領(lǐng)域，但因其穩(wěn)定性的限制，設(shè)計(jì)和開發(fā)人工納米孔道材料越來越受到人們的關(guān)注。相比于生物材料，無機(jī)納米材料本身不僅具有穩(wěn)定的物理性質(zhì)、并且其形狀和表面功能化可調(diào)控，這就為智能納米孔道系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和開發(fā)提供了良好的研究平臺(tái)。目前以納米孔道為基礎(chǔ)在其孔道進(jìn)行功能化修飾建立分子離子分離篩選體系已經(jīng)成為相關(guān)領(lǐng)域科研人員的研究重點(diǎn)。本文通過在AAO孔道內(nèi)進(jìn)行功能化修飾，探究其對(duì)分子的分離篩選作用，主要得到了以下結(jié)論：（1）孔道內(nèi)金納米顆粒尺寸與密度的雙向調(diào)控。本工作利用聚多巴胺粘附性和還原性的雙重性質(zhì)，結(jié)合氯金酸的強(qiáng)氧化性，采用真空抽濾的方法，在AAO納米孔道的內(nèi)壁成功修飾了分散的金納米顆粒。此外，通過調(diào)節(jié)聚多巴胺溶液濃度，氯金酸濃度的條件，實(shí)現(xiàn)了AuNPs在納米孔道內(nèi)生長(zhǎng)的可控性。本實(shí)驗(yàn)中金納米顆粒生長(zhǎng)的最佳濃度為PDA5mg/mL、HAuCl42mM；（2）孔道內(nèi)修飾疏水分子對(duì)親、疏水分子的分離篩選。利用Au原子與巰基結(jié)合形成Au-S鍵，在修飾Au顆粒的AAO膜修飾了疏水分子二十二烷基硫醇，經(jīng)過電化學(xué)驅(qū)動(dòng)，修飾了二十二烷基硫醇的AAO膜阻礙親水分子亞甲基藍(lán)的遷移，促進(jìn)疏水分子阿米替林的遷移，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)親、疏水分子的分離篩選。（3）修飾手性分子對(duì)蛋白質(zhì)的選擇性運(yùn)輸。利用Au原子與巰基結(jié)合形成Au-S鍵，在修飾Au顆粒的AAO膜選擇性的修飾了D-半胱氨酸與L-半胱氨酸，經(jīng)過電化學(xué)驅(qū)動(dòng)，發(fā)現(xiàn)修飾了D-半胱氨酸的AAO膜比修飾L-半胱氨酸的AAO膜更容易通過BSA分子，對(duì)BSA分子的運(yùn)輸具有選擇性。本實(shí)驗(yàn)制備的疏水分子功能化的AAO膜納米孔道，阻礙親水分子遷移，促進(jìn)疏水分子遷移，對(duì)親、疏水分子具有較好的分離篩選作用。但由于時(shí)間原因，沒有進(jìn)一步探究親水分子功能化的AAO膜是否具有促進(jìn)親水分子遷移，阻礙疏水分子遷移的性質(zhì)。后續(xù)研究可以在AAO膜中修飾親水分子，探究其對(duì)親、疏水分子的分離篩選。本實(shí)驗(yàn)制備的手性L-半胱氨酸與D-半胱氨酸功能化的AAO膜，雖然對(duì)BSA具有選擇性運(yùn)輸，然而由于時(shí)間有限，很多影響條件尚未進(jìn)行深入探討，例如驅(qū)動(dòng)時(shí)間、驅(qū)動(dòng)電壓、BSA濃度等，后續(xù)仍需深入探討，進(jìn)一步完善此實(shí)驗(yàn)。致謝轉(zhuǎn)眼間，大學(xué)生活已經(jīng)接近尾聲。在大學(xué)這四年時(shí)光里，我的各種能力都得到了提高，綜合素養(yǎng)得到了提升，這四年也必將成為我最美好的回憶。我相信大學(xué)四年我所學(xué)到的知識(shí)與能力對(duì)我今后的發(fā)展有莫大的幫助。在做畢業(yè)設(shè)計(jì)這段時(shí)間里，首先我想感謝學(xué)校，感謝學(xué)校給我們提供良好的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。其次我特別想感謝我的指導(dǎo)老師——高鵬程教授，在我做畢設(shè)實(shí)驗(yàn)遇到困難時(shí)，高老師總是耐心地給我分析問題所在，并提出寶貴的意見。這樣我的實(shí)驗(yàn)才能夠順利的完成。而且高老師對(duì)實(shí)驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度，對(duì)科研堅(jiān)持的精神，令我感到欽佩，值得我用一生去學(xué)習(xí)。然后，我特別感謝帶我的司志曉師兄，在我實(shí)驗(yàn)中，師兄認(rèn)真的交我各種實(shí)驗(yàn)儀器與軟件的使用方法，讓我熟悉了各種儀器的基本操作。在我實(shí)驗(yàn)遇到問題時(shí)，師兄也竭盡所能的幫助我。無論實(shí)驗(yàn)上還是生活中，都給了我莫大的幫助。在這里，希望師兄實(shí)驗(yàn)有所突破，學(xué)業(yè)有成。最后，我想感謝全部支持我的人，包括朋友、家人、同學(xué)。希望你們健健康康。參考文獻(xiàn)[1]李素娟.納米孔道材料的限域性質(zhì)及其在生物分析中應(yīng)用[D].南京大學(xué),2010.[2]MacaraIG.Transportintoandoutofthenucleus[J].MicrobiolMolBiolRev,2001,65(4):570-594.[3]MarforiM,MynottA,EllisJJ,etal.Molecularbasisforspecificityofnuclearimportandpredictionofnuclearlocalization.[J].BiochimicaEtBiophysicaActa,2011,1813(9):1562-77.[4]Holland,E.M,Braun,etal.Thenatureofrhodopsin-triggeredphotocurrentsinChlamydomonas.I.Kineticsandinfluenceofdivalentions[J].BiophysicalJournal,1996,70(2):924-31.[5]HaqueF,LiJ,WuHC,etal.Solid-StateandBiologicalNanoporeforReal-TimeSensingofSingleChemicalandSequencingofDNA[J].Cheminform,2013,8(1):56-74.[6]DeamerDW,BrantonD.Characterizationofnucleicacidsbynanoporeanalysis.[J].AccountsofChemicalResearch,2002,35(10):817-25.[7]&AmpHB,CremerPS.progressStochasticsensorsinspiredbybiology[J].Nature,2001,413(6852):226-230.[8]Liu,N.W,Datta,A,Liu,C.Y,etal.FabricationofAnodic-AluminaFilmswithCustom-DesignedArraysofNanochannels[J].AdvancedMaterials,2005,17(2):222-225.[9]MussiV,FanzioP,RepettoL,etal.DNA-functionalizedSi3N4nanoporebiosensors[C]//NationalNanomedicineConference.2009.[10]UmeharaS,PourmandN,WebbCD,etal.Currentrectificationwithpoly-l-lysine-coatedquartznanopipettes[J].Nanoletters,2006,6(11):2486-2492.[11]ZhangH,TianY,JiangL.Fundamentalstudiesandpracticalapplicationsofbio-inspiredsmartsolid-statenanoporesandnanochannels[J].NanoToday,2016,11(1):61-81.[12]NishizawaM,MenonVP,MartinCR.Metalnanotubulemembraneswithelectrochemicallyswitchableion-transportselectivity[J].Science,1995,268(5211):700-702.[13]PerryJL,GuoP,JohnsonSK,etal.Fabricationofbiodegradablenanotesttubesbytemplatesynthesis[J].Nanomedicine,2010,5(8):1151-1160.[14]NozawaK,OsonoC,SugawaraM.BiotinylatedMCM-41channelsasasensingelementinplanarbilayerlipidmembranes[J].Sensors&ActuatorsBChemical,2007,126(2):632-640.[15]LiJ,SteinD,McMullanC,etal.Ion-beamsculptingatnanometrelengthscales[J].Nature,2001,412(6843):166-169.[16]JirageKB,HulteenJC,MartinCR.Nanotubule-BasedMolecular-FiltrationMembranes[J].Science,1997,278(5338):655-658.[17]ChunKY,StroeveP.Proteintransportinnanoporousmembranesmodifiedwithself-assembledmonolayersoffunctionalizedthiols[J].Langmuir,2002,18(12):4653-4658.[18]JirageKB,HulteenJC,MartinCR.Effectofthiolchemisorptiononthetransportpropertiesofgoldnanotubulemembranes.[J].AnalyticalChemistry,1999,71(21):4913-8.[19]MubarakAli.FunctionalizationandApplicationofIonTrackEtchedNanochannelsinPolymerMembranes[D].Ph.D.Dissertation,2009.[20]NishizawaM,MenonVP,MartinCR.Metalnanotubulemembraneswithelectrochemicallyswitchableion-transportselectivity.[J].Science,1995,268(5211):700-702.[21]JillianLPerry,PengGuo,ShannonKJohnson,etal.Fabricationofbiodegradablenanotesttubesbytemplatesynthesis[J].Nanomedicine,2010,5(8):1151-1160.[22]KeiichiroNozawa,ChieOsono,andMasaoSugawara.BiotinylatedMCM-41channelsasasensingelementinplanarbilayerlipidmembranes[J].SensorsandActuatorsB:Chemical,2007,126(2):632-640.[23]GuoW,TianY,JiangL.Asymmetriciontransportthroughion-channel-mimeticsolid-statenanopores.[J].AccChemRes,2013,46(12):2834-2846.[24]TianY,WenL,HouX,etal.Bioinspiredion-transportpropertiesofsolid-statesinglenanochannelsandtheirapplicationsinsensing.[J].[25]HoworkaS,SiwyZ.Nanoporeanalytics:sensingofsinglemolecules[J].ChemicalSocietyReviews,2009,38(8):2360-2384.[26]MengH,LiuH,KuaiH,etal.ChemInformAbstract:Aptamer‐IntegratedDNANanostructuresforBiosensing,BioimagingandCancerTherapy[