(自動)核酸提取儀校準規(guī)范

JJF1874—20201(自動)核酸提取儀校準規(guī)范1范圍本規(guī)范適用于全自動核酸提取儀和半自動核酸提取儀的校準。2引用文件本規(guī)范引用了下列文件:JJF1059.1—2012測量不確定度評定與表示JJF1101—2019環(huán)境試驗設備溫度、濕度校準規(guī)范JJF1527—2015聚合酶鏈反應分析儀校準規(guī)范凡是注日期的引用文件,僅注日期的版本適用于本規(guī)范;凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本規(guī)范。3概述(自動)核酸提取儀(以下簡稱提取儀)是應用核酸提取試劑完成樣本核酸提取的一類核酸提取純化設備,其原理是在一定溫度、振動等條件下,對樣本進行裂解、提取和純化。提取儀由溫控系統(tǒng)、振蕩系統(tǒng)、取液系統(tǒng)和分離純化系統(tǒng)全部或部分組成。4計量特性4.1溫度示值誤差4.2溫度均勻性4.3溫度穩(wěn)定性4.4振動頻率示值誤差4.5振動頻率穩(wěn)定性4.6取液量示值誤差4.7取液量重復性4.8取液量一致性4.9核酸提取回收率一致性4.10核酸提取回收率重復性4.11核酸提取回收率5校準條件5.1環(huán)境條件5.1.1環(huán)境溫度:(10~30)℃。5.1.2相對濕度:≤80%。5.1.3提取儀所在室內不得有明顯的機械振動,無電磁干擾。JJF1874—20202 5.1.4其他允許的環(huán)境條件。 5.2校準設備和標準物質5.2.1溫度測量裝置可至少同時測量7組溫度數(shù)據(jù),測量范圍(0~120)℃,最大允許誤差±0.3℃。5.2.2振動頻率測量裝置測量范圍為(0.1~500)Hz,0.1級或優(yōu)于0.1級。5.2.3電子天平分度值0.1mg,最大稱量值≥200g,滿足?級要求,經(jīng)過計量檢定或校準。5.2.4核酸標準物質5.2.濃度≥1000ng/μL,相對擴展不確定度Urel≤5%(k=2)。經(jīng)過校準,或用有證標準物質進行標定。6校準項目和校準方法6.1溫度示值誤差溫度點一般選擇55℃、65℃、90℃,或者其他有實際需要的溫度為校準點。使用溫度測量裝置,將溫度傳感器固定在提取儀的加熱模塊上,溫度傳感器均勻分布,保證溫度傳感器與加熱模塊貼合緊密。對于不同加熱模塊的提取儀,可根據(jù)實際情況均勻選取測量點,測溫點數(shù)選取規(guī)則如下:提取儀孔位數(shù)48位~96位,測溫點選7個;提取儀孔位數(shù)8位~48位,測溫點選5個;提取儀孔位數(shù)8位及以下的,測溫點選3個。設定被校提取儀的校準溫度,穩(wěn)定10min或以上,待溫度穩(wěn)定后,讀取測溫點的溫度值,根據(jù)公式(1)和公式(2)計算溫度的示值誤差。ΔTa=Ts-T(1)T=式中:Tii=1ΔTa———溫控工作區(qū)域內溫度示值誤差,℃;Ts———溫控工作區(qū)域內設定溫度值,℃; T———所有測溫點溫度傳感器測量值的平均值,℃;Ti———第i個溫度傳感器測量值,℃;n———測溫點數(shù)量。6.2溫度均勻性分別測試提取儀溫度設定為55℃、65℃、90℃(也可選擇其他有實際需要的溫度進行測試)時工作區(qū)域的溫度均勻性。根據(jù)公式(3)計算溫度的均勻性。ΔTu=Tmax-Tmin(3)式中:ΔTu———溫度均勻性,℃;JJF1874—20203Tmax—所有測溫點溫度傳感器測量值的最大值,℃;Tmin—所有測溫點溫度傳感器測量值的最小值,℃。注:若提取儀提取通道少于3個,則不做均勻性考察。6.3溫度穩(wěn)定性測試提取儀溫度設定為65℃時加熱區(qū)域的溫度穩(wěn)定性。待提取儀溫度穩(wěn)定后,測試10min,隔1min記錄一次所有測溫點溫度傳感器測量平均值,這些平均值極差的一半,冠以±號表示溫度的穩(wěn)定性。根據(jù)公式(4)計算溫度的穩(wěn)定性。ΔTw=±(Tmax-Tmin)(4)式中:ΔTw—溫度穩(wěn)定性,℃;Tmax—所有測溫點溫度傳感器測量平均值中的最大值,℃;Tmin—所有測溫點溫度傳感器測量平均值中的最小值,℃。6.4振動頻率示值誤差校準振動頻率點選取提取儀頻率設定最大值的20%(低)、50%(中)、80%(高)測量。待提取儀穩(wěn)定5min后,設定待測頻率值,分別測量低、中、高提取儀振動頻率的示值,每個頻率測量3次,根據(jù)公式(5)和公式(6)計算振動頻率的示值誤差。ΔFa=Fs-F(5)F=Fi(6) ΔFa ΔFa—振動頻率示值誤差,Hz;Fs—振動頻率設定值,Hz; F—n次測量振動頻率的平均值,Hz;Fi—第i次振動頻率測量值,Hz;n—測量次數(shù)。注:若提取儀振動頻率沒有具體數(shù)值,則此項可以不做。6.5振動頻率穩(wěn)定性測試提取儀振動頻率設定為中等值時振動頻率的穩(wěn)定性。選取振動頻率為設定最大值的50%,待提取儀振動穩(wěn)定后,測試10min,隔1min記一次振動頻率,10min之內測得的振動頻率極差的一半,冠以±號表示振動頻率的穩(wěn)定性。根據(jù)公式(7)計算振動頻率的穩(wěn)定性。ΔFw=±(Fmax-Fmin)(7)式中:ΔFw—振動頻率穩(wěn)定性,Hz;4 Fmax—振動頻率測量值的最大值,Hz; Fmin—振動頻率測量值的最小值,Hz。6.6取液量示值誤差分別設定提取儀取液量為50μL、100μL、200μL,或者其他有實際需要的取液量作為校準點。超純水作為被取液,選擇一個通道,每個取液量測量3次,用電子天平稱量所取液體質量,根據(jù)實驗溫度時水的密度,將所取液體的質量換算成體積,根據(jù)公式(8)和公式(9)計算取液量的示值誤差。ΔVa=Vs-V(8)1nV1nΔVa—取液量示值誤差,μL;Vs—取液量設定值,μL;Vii=1(9)V—n次取液量測量值的平均值,μL;Vi—第i次取液量測量值,μL;n—測量次數(shù)。6.7取液量重復性測試取液量設定值為100μL時提取儀取液量的重復性。選擇一個通道重復取液7次,用電子天平稱量所取液體質量,根據(jù)實驗溫度時水的密度,將所取液體的質量換算成體積,根據(jù)公式(10)計算不同取液量的重復性。RSD=(nV-iV)2××100%(10)式中:RSD—相對標準偏差,%;Vi—第i次取液量測量值,μL;V—n次取液量的平均值,μL;n—取液次數(shù)。6.8取液量一致性測試取液量設定值為100μL時提取儀取液量的一致性。用提取儀的多通道取液器取液一次,用電子天平分別稱量各通道取液的質量,根據(jù)實驗溫度時水的密度,將所取液體的質量換算成體積,所有通道取液體積的極差表示取液量的一致性。根據(jù)公式(11)計算取液量的一致性。ΔVu=Vmax-Vmin(11)式中:ΔVu—取液量一致性,μL;Vmax—所有通道取液量的最大值,μL;5Vmin—所有通道取液量的最小值,μL。注:若提取儀取液通道少于3個,則此項可以不做。6.9核酸提取回收率一致性a)選擇有證核酸標準物質,采用微量分光光度計測量其濃度,取3次測量的平均值作為核酸提取前的初始濃度。b)用提取儀對有證核酸標準物質進行核酸提取。根據(jù)實際情況,參考6.1中的選點方式,均勻選取測量點進行一致性考察。c)將每個孔中提取好的核酸樣品溶液,分別用微量分光光度計測量其濃度。d)對比提取前后的核酸濃度,計算提取回收率。測試核酸標準溶液提取回收率的一致性,按6.1中的原則選取測試孔位,測量每個孔位提取后樣品溶液中的核酸回收濃度。根據(jù)公式(12)、公式(13)和公式(14)計算所選孔位間核酸提取回收率的一致性。ΔCu=λ×(Cmax-Cmin)(12)λ=(13)ΔRu=×100%(14)式中:ΔCu—核酸回收濃度最大差值,ng/μL;Cmax—所有核酸回收濃度測量值的最大值,ng/μL;Cmin—所有核酸回收濃度測量值的最小值,ng/μL;λ—提取后的總體積和提取前加入標準物質的體積比值;Vc—提取后的總體積,μL;V0—提取前加入標準物質的體積,μL;C0—初始濃度,ng/μL;ΔRu—回收率一致性,%。注:若提取儀提取通道少于3個,則不做一致性考察。6.10核酸提取回收率重復性按6.1中的原則選取測試孔位進行核酸提取,把所有測試孔位提取后的樣品溶液混合均勻,用微量分光光度計測量核酸濃度,計算核酸提取回收率作為一次測量結果,重復提取測量3次,根據(jù)公式(15)計算核酸提取回收率的重復性。RSD=××100%(15)式中:RSD—相對標準偏差,%;Rmax—n次回收率測量值中的最大值,%;Rmin—n次回收率測量值中的最小值,%; R—n次測量回收率的平均值,%;6R=λ× Cn—極差系數(shù),n=3時,CnR=λ× 6.11核酸提取回收率 CC0×100%(16)把6.9得到的所有測試孔位提取后的樣品溶液混合均勻,用微量分光光度計測量核酸濃度,重復測量3次,根據(jù)公式(16)和公式(17) CC0×100%(16)1nC1n式中:R—核酸提取回收率,%;Cii=1(17)C—n次測量濃度的平均值,ng/μL;C0—初始濃度,ng/μL。7校準結果表達經(jīng)校準后的提取儀,出具校準證書,校準證書應符合JJF1071—2010中5.12的要求,校準原始記錄格式參見附錄A,校準證書(內頁)格式參見附錄B。8復校時間間隔由于復校時間間隔的長短是由提取儀的使用情況、使用者、提取儀本身質量等諸因素所決定的,因此,送校單位可根據(jù)實際使用情況自主決定復校時間間隔。建議復校時間間隔不超過1年。JJF1874—20207附錄A校準原始記錄格式(參考)(自動)核酸提取儀校準記錄共3頁第1頁儀器名稱室溫/℃儀器型號相對濕度/%制造廠校準員出廠編號核驗員委托單位委托單號記錄編號證書編號聯(lián)系人及電話校準日期校準使用的儀器設備名稱測量范圍不確定度/準確度等級/最大允許誤差檢定/校準證書編號有效期至1.溫度示值誤差及均勻性溫度℃Ti/℃T℃ aΔTa℃ΔTu℃12345675565902.溫度穩(wěn)定性溫度℃ T/℃ ΔTw℃0min1min2min3min4min5min6min7min8min9min10min658共3頁第2頁3.振動頻率示值誤差振動頻率Fs/HzFi/Hz F/Hz ΔFa/Hz123低中高4.振動頻率穩(wěn)定性振動頻率F/HzΔFw/Hz0min1min2min3min4min5min6min7min8min9min10min中5.取液量示值誤差取液量/μLVi/μL V/μL ΔVa/μL123501002006.取液量重復性取液量/μLVi/μL V/μLRSD/%12345671007.取液量一致性取液量/μLV/μLΔVu/μL123456781008.核酸提取回收率一致性Vc/μLV0/μLλ9共3頁第3頁C0/(ng/μL)Cu/(ng/μL)ΔCu/(ng/μL)ΔRu/%12345679.核酸提取回收率重復性C0/(ng/μL)Ci/(ng/μL)Ri/%Rmax-RminCnR/%RSD/%12312310.核酸提取回收率C0/(ng/μL)Ci/(ng/μL) C/(ng/μL)R/%12310附錄B校準證書(內頁)格式校準結果校準項目校準結果溫度示值誤差/℃標稱值測量值示值誤差擴展不確定度(k=2)溫度均勻性/℃標稱值均勻性溫度穩(wěn)定性/℃振動頻率示值誤差/Hz標稱值測量值示值誤差擴展不確定度(k=2)振動頻率穩(wěn)定性/Hz取液量示值誤差/μL標稱值測量值示值誤差擴展不確定度(k=2)取液量一致性/μL標稱值一致性11表(續(xù))取液量重復性標稱值/μL重復性/%核酸提取回收率一致性/%核酸提取回收率重復性/%核酸提取回收率/%核酸提取回收率擴展不確定度/%(k=2)校準員:核驗員:12附錄C溫度示值誤差校準結果的不確定度評定示例C.1測量模型ΔTa=Ts-T(C.1)式中: ΔTa—溫控工作區(qū)域內溫度示值誤差,℃;Ts—溫控工作區(qū)域內設定溫度值,℃; T—所有測溫點溫度傳感器測量值的平均值,℃。C.2不確定度來源溫度示值誤差校準結果的不確定度來源主要為:a)測量重復性引入的不確定度;b)溫度測量裝置引入的不確定度。C.3標準不確定度分量的評定C.3.1測量重復性引入的標準不確定度u(T)在各個溫度測量時間段內,讀取7個測溫探頭的數(shù)據(jù),見表C.1,計算其實驗標準偏差s。表C.1重復性引入不確定度數(shù)據(jù)溫度/℃測量結果Ti/℃s/℃12345675550.3150.8950.7851.0451.8951.7650.710.576560.8459.9861.2560.9961.3361.0459.660.659084.0384.4184.8384.5284.6683.0484.670.61根據(jù)測量結果計算: (Ti-(Ti-T)2u(T)=結果見表C.2。(C.2)(C.3)C.3.2溫度測量裝置引入的標準不確定度u(Ts)溫度測量裝置校準不確定度按最大允許誤差計算。u(Ts)=a/k=0.3℃/3=0.17℃13C.4標準不確定度分量匯總表表C.2標準不確定度分量匯總表溫度/℃標準不確定度分量 u(T)/℃ u(Ts)/℃550.570.17650.650.17900.610.17C.5合成標準不確定度合成標準不確定為uc(ΔTa)=u2(T)+u2(Ts)結果列于表C.3。C.6擴展不確定度取包含因子k=2,則擴展不確uc(ΔTa)結果列于表C.3。表C.3合成標準不確定度和擴展不確定度溫度/℃ uc(ΔTa)/℃ U/℃包含因子k550.591.22650.671.42900.631.3214附錄D振動示值誤差校準結果的不確定度評定示例D.1測量模型ΔFa=Fs-F(D.1)式中: ΔFa—振動頻率示值誤差,Hz;Fs—振動頻率設定值,Hz; F—n次測量振動頻率的平均值,Hz。D.2不確定度來源振動示值誤差校準結果的不確定度來源主要為:a)測量重復性引入的不確定度;b)標準頻率檢測儀引入的不確定度。D.3標準不確定度分量的評定D.3.1重復性引入的標準不確定度u(F)在低、中、高三個頻率振動點,分別讀取10次檢測數(shù)據(jù),結果見表D.1,計算其實驗標準偏差s。表D.1重復性引入不確定度數(shù)據(jù)頻率振動點Fs/Hz測量結果Fi/Hzs/Hz12345678910低22.22.12.42.32.22.12.12.32.22.10.11中55.15.35.45.25.45.15.35.25.35.10.12高88.38.28.48.48.18.28.18.38.38.20.11根據(jù)測量結果計算: (Fi-(Fi-F)2u(F)=結果見表D.2。(D.2)(D.3)D.3.2振動頻率測量裝置引入的標準不確定度u2(Fs)振動頻率測量裝置校準不確定度按裝置的最大允許誤差計算。u(Fs)=a/k=FS×0.1%/3=0.29Hz15D.4標準不確定度分量匯總表表D.2標準不確定度分量匯總表頻率振動點Fs/Hz標準不確定度分量 u(F)/Hz u(Fs)/Hz低20.0640.29中50.0690.29高80.0640.29D.5合成標準不確定度合成標準不確定度為uc(ΔFa)=u2(F)+u2(Fs)結果列于表D.3。D.6擴展不確定度取包含因子k=2,則擴展不確uc(ΔFa)結果列于表D.3。表D.3合成標準不確定度和擴展不確定度頻率振動點Fs/Hz uc(ΔFa)/Hz U/Hz包含因子k低20.300.602中50.300.602高80.300.60216附錄E取液量示值誤差校準結果的不確定度評定示例E.1測量模型ΔVa=Vs-V(E.1)式中: ΔVa—取液量示值誤差,μL;Vs—取液量設定值,μL; V—n次取液量測量值的平均值,μL;E.2不確定度來源取液量示值誤差校準結果的不確定度來源主要為:a)測量重復性引入的不確定度;b)電子天平引入的不確定度。E.3標準不確定度分量的評定E.3.1重復性引入的標準不確定度u(V)設定取液量為50μL、100μL、200μL,每個取液量設定點分別測量10次取液量,結果見表E.1,計算其實驗標準偏差s。表E.1重復性引入不確定度數(shù)據(jù)Vs/μLVi/μLs/μL123456789105047.2450.1148.6949.1048.1848.2147.8848.5147.7147.840.8110099.4599.38100.299.1697.8499.4598.3599.8698.3597.500.89200200.1198.6200.9198.2199.0200.3199.8198.6199.5200.50.92根據(jù)測量結果計算: (Vi-V(Vi-V)2u(V)=結果見表E.2。(E.2)(E.3)E.3.2電子天平引入的標準不確定度u(Vs)電子天平引入的不確定度按電子天平的最大允許誤差計算。u(Vs)=a/k=0.5mg/(0.996511mg/μL×3)=0.29μL17E.4標準不確定度分量匯總表表E.2標準不確定度分量匯總表Vs/μL標準不確定度分量 u(V)/μL u(Vs)/μL500.470.291000.510.292000.530.29E.5合成標準不確定度合成標準不確定度為uc(ΔVa)=u2(V)+u2(Vs)結果列于表E.3。E.6擴展不確定度取包含因子k=2,則擴展不確uc(ΔVa)結果列于表E.3。表E.3合成標準不確定度和擴展不確定度Vs/μL uc(ΔVa)/μL U/μL包含因子k500.551.121000.591.222000.601.22JJF1874—202018 附錄F 核酸提取回收率校準結果不確定度評定示例F.1測量模型R=λ××100%(F.1)C=Ci(F.2)式中:R—核酸提取回收率;C—n次測