DB5132T 88-2023 牦牛肉PCR-膜芯片技術(shù)檢驗(yàn)方法

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DB5132四川?。ò尾刈迩甲遄灾沃荩┑胤綐?biāo)準(zhǔn)DB5132/T88—2023牦牛肉PCR—膜芯片技術(shù)檢驗(yàn)方法IdentificationofYakMeatwithPCR-membraneChipTechnology2023-10-26發(fā)布 2023-12-25實(shí)施阿壩藏族羌族自治州市場(chǎng)監(jiān)督管理局 發(fā)布DB5132/T88DB5132/T88—2023PAGE\*ROMANPAGE\*ROMANIII目 次前言 II引言 III范圍 1規(guī)范性引用文件 1術(shù)語和定義、縮略語 1術(shù)語和定義 1縮略語 1原理 2設(shè)備與材料 2主要試劑 2實(shí)驗(yàn)用水 2檢驗(yàn)步驟 2PCR引物及探針 2樣品處理與DNA提取 3多重PCR反應(yīng)體系 4膜芯片制備 4雜交顯色 4結(jié)果判讀 5結(jié)果表述 5生物安全及檢測(cè)過程中防止交叉污染的措施 5參考文獻(xiàn) 7前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》給出的規(guī)則起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由阿壩藏族羌族自治州農(nóng)業(yè)農(nóng)村局提出并歸口。本文件主要起草人：何明珠、江明鋒、史贇學(xué)、趙睿驍、蒲華榮。引 言本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)提請(qǐng)注意,聲明符合本文件時(shí)，可能涉及到專利號(hào)為ZL201910400450.2《一種牦牛肉鑒定試劑盒》相關(guān)的專利的使用。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)對(duì)于該專利的真實(shí)性、有效性和范圍無任何立場(chǎng)。該專利持有人已向本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)承諾。他愿意同任何申請(qǐng)人在合理且無歧視的條款和條件下，專利持有人姓名:江明鋒(西南民族大學(xué)),文勇立(西南民族大學(xué)),王譽(yù)(西南民族大學(xué))。DB5132/T88DB5132/T88—2023PAGEPAGE1牦牛肉PCR-膜芯片技術(shù)檢驗(yàn)方法范圍本文件規(guī)定了牦牛肉動(dòng)物源性成分的PCR-膜芯片技術(shù)檢測(cè)方法。規(guī)范性引用文件GB/T682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)GB/T34796水溶液中核酸的濃度和純度檢測(cè)術(shù)語和定義、縮略語術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) polymerasechainreaction；PCR在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為伸起點(diǎn)，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程。多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) multiplexPCR在同一PCR反應(yīng)體系中加入兩對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)。膜芯片技術(shù) membraneChipTechnology將預(yù)先制備的DNA縮略語PCR：polymerasechainreaction；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA：DeoxyriboNucleicAcid；脫氧核糖核苷酸SSC：SalineSodiumCitratebuffer；雜交印記緩沖液PCRMasterBuffer：PCR緩沖液dNTP：deoxy-ribonucleosidetriphosphate；脫氧核糖核苷三磷酸TaqPolymerase：Thermusaquaticus聚合酶SSPE：核酸雜交緩沖液Mix：PCR的預(yù)混物，含有Taq酶、dNTP混合物、MgCl2及優(yōu)化的緩沖體系ddH2O：雙重蒸餾水原理DNA模板進(jìn)行多重聚合設(shè)備與材料除實(shí)驗(yàn)室滅菌及常規(guī)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：5.1 pH（0.01）天平（0.1g）PCR生物安全柜MS-)（mm.45m）主要試劑DNA15×SSC去活化液（100mmol/L，NaOH）。2SP，.1%DS。（×SE，.5%DS。（1∶200）。12SP，.5%DS。2.3o/LNl0mlLNH2O4、0moEDAN2H為.4。顯色液（BCIP/NBT、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氯化硝基四氮唑蘭）。R（0o/L5o/L。RMsrfr（00moLrs-Hl5moLMl2，H=.0。NTs（00μo/L。aqoyerase（.5U/L。實(shí)驗(yàn)用水實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T6682-2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》中一級(jí)水的要求。檢驗(yàn)步驟PCR引物及探針引物和探針序列見表1。表1 PCR引物信息物種目的基因引物/探針序列（5'-3'）內(nèi)參actin基因F：5’-GAGCGCAAGTACTCTGTGTGGAT-3’R：5’iinAAAGCTTGCGTGACG3’5’mioinrCTCACCTCAGCGATTGGTC-GCAAGCAGGAGTA-3’豬COXI基因F：5’-GCTTCATCTTCCTATTCACCGT-3’R：5’iinGAAACAAGTTAGGAG3’探針：5’milikrCTCACTTCAGAGAGTGATAGCAGCAGAGA3’山羊cytb基因F：5’-TATGCATGTAGGACGAGGCCTATA-3’R：5’iinATATTGACAGGTGTGC3’’mininrCTACATAGGAAAAATCTT’黃牛12SrRNAF：5’-GTGACAAAAATTAAGCCATAAACGA-3’R：5’iinCAGGCTTTAAGCTGT3’’mininrCAAAGACCTACAAAAGGT3’水牛12SrRNAF：5’-GTGACAAAAATTAAGCCATAAACGA-3’R：5’iinGTGTAAGAGCATTCGTG3’’mininrCAAGCCACGCAAAAGAGTA3’牦牛12SrRNAF：5’-GATACCCCACTATGCTTAGCC-3’R：5’iinATCATATACTTCTGA3’’mininrCTACCTAGAGACCATGA3’鴨12SrRNAF：5’-GATACCCCACTATGCTTAGCC-3’R：5’iinAGGGGGGTGGGTG3’’mininrCCCGTCTGAACGAGATCAC3’狗12SrRNAF：5’-GATACCCCACTATGCTTAGCC-3’R：5’iinAATCGGAAAGTCTGG3’’mininrCGTACTATGGGTGGAAAA3’兔12SrRNAF：5’-GATACCCCACTATGCTTAGCC-3’R：5’iinACTACGTTTAGGGG3’’mininrCAACCTACATCTTCCACTAGC3’雞12SrRNAF：5’-GATACCCCACTATGCTTAGCC-3’R：5’iinGTATGACTACGTGT3’’mininrCCCACACGCCACAACGC3’樣品處理與DNA提取抽取牦牛鮮肉（牦牛肉制品）經(jīng)制備后，使用動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒提取并純化DNA。DNA按GB/T34796《水溶液中核酸的濃度和純度檢測(cè)》規(guī)定的方法進(jìn)行，DNA的濃度≥10%。PCR以.2中提取并純化后的DNA為模板，在0μL體系中加入Mx酶0L、正向引物（0μoL.5μ0o/L.5μDNA00gdH2O8L9510min9430s、6015s、7215s、3372℃延伸3min。得到擴(kuò)增產(chǎn)物。膜芯片制備將尼龍轉(zhuǎn)印膜制備成1.2cm×1.8cm的膜條，將裁好的尼龍膜放置于雙蒸水中浸泡15min，再用5×SC5in，0℃5μoL5μoL5o/L）N5μoL圖1。圖1芯片點(diǎn)樣模式圖雜交顯色PCR產(chǎn)物變性：PCR產(chǎn)物95℃5min使其解鏈，放置冰上備用。PCR膜芯片去活化：將制備好的膜芯片放入雜交盒內(nèi)，芯片標(biāo)簽正面朝上，加入1mL去活化液37℃孵育8min。洗膜：加入1mL去活化清洗液605min。PCR產(chǎn)物與1mLr/min孵育45min。洗膜：吸除雜交體系液，加入1mL預(yù)熱好的雜交清洗液，水平搖床52℃，90r/min，震蕩清洗5min，洗滌2次。孵育：吸除雜交清洗液，加入預(yù)熱好的酶孵育液，42℃水平搖床90r/min，震蕩孵育30min。洗膜：吸除酶孵育液，加入1mL預(yù)熱好的孵育清洗液1，42℃水平搖床90r/min，震蕩清洗5，洗滌2次；吸除孵育清洗液1mL預(yù)熱好的孵育清洗液水平搖床90r/min，震蕩清洗5min，洗滌2次。1mL顯色液，℃靜置1mL去離子水37℃洗滌2次，待膜芯片干燥后進(jìn)行結(jié)果判讀。具體流程如表2所示。表2雜交流程表程序名稱試劑名稱溫度/℃時(shí)間/min去活化去活化液378去活化清洗去活化清洗液605雜交雜交液4545雜交清洗雜交清洗液525雜交清洗雜交清洗液525酶孵育孵育液4230孵育清洗1孵育清洗液1425孵育清洗1孵育清洗液1425孵育清洗2孵育清洗液2375孵育清洗2孵育清洗液2375顯色顯色液3715顯色清洗去離子水375顯色清洗去離子水375結(jié)果判讀根據(jù)雜交點(diǎn)顯色情況進(jìn)行結(jié)果判讀。結(jié)果判讀表3 膜芯片結(jié)果判定結(jié)果類型內(nèi)參基因PCNC靶基因結(jié)果判定1雜交失敗，重復(fù)試驗(yàn)2-+--PCR擴(kuò)增失敗，重復(fù)試驗(yàn)3++--樣品中不含本標(biāo)準(zhǔn)中9