精子獲能機理的研究進展

精子獲能機理的研究進展

能量是飼料精子在精子形成之前必須經(jīng)歷的一個成熟過程。研究表明,經(jīng)過附睪成熟,精子表面被覆了蛋白和多氨類等對獲能有抑制作用的去能因子(Decapacitationfactors,DF),所以,精子離開雄性生殖道后,不具備立即與卵子的受精能力,必須在雌性生殖道內(nèi)進一步成熟,在形態(tài)和生理上發(fā)生特定的變化,才具備受精能力。獲能精子一旦與精漿和附睪液接觸,可去獲能,表明精漿和附睪液中都存在去能因子。體外獲能和人工誘導(dǎo)受精技術(shù)的問世使這一生理學過程得以在體外完成和驗證,并為體外模擬獲能生理學過程,深入研究獲能機制提供便利條件。哺乳動物是人類生活所需畜產(chǎn)品的主要來源,其繁殖效率直接關(guān)系到畜牧業(yè)的生產(chǎn)效率和畜產(chǎn)品質(zhì)量,而精子獲能效率的提高是哺乳動物受精率和繁殖率提高的前提。獲能前后精子發(fā)生了一系列理化變化,這些變化為深入探究獲能機制提供了重要線索。半個世紀以來,通過對精子獲能方法及機制的大量研究,已建立了較為理想的獲能技術(shù)及評價方法,獲能機制研究也取得了一定進展。精子是終端分化細胞,獲能過程中不會出現(xiàn)蛋白表達,這幾乎已成為繁殖領(lǐng)域眾多學者的共識。但是,近幾年的研究證明,精子中可能存在蛋白表達,尤其是獲能過程中,精子通過線粒體型核糖體進行了Mups蛋白家族等多種繁殖相關(guān)蛋白的翻譯。隨著蛋白組學、生物信息學等的發(fā)展,獲能前后的差異蛋白不斷在牛、豬、鼠、人等物種中被鑒定出來,為進一步揭示獲能機制提供了理論基礎(chǔ)與技術(shù)支持。對人、小鼠等的相關(guān)研究表明,蛋白酪氨酸磷酸化(PTP)可促進精子獲能,并使超激活運動得以維持;Ca2+、葡萄糖在PTP過程中起到了重要調(diào)控作用,但其調(diào)控機理還存在爭議,對精子磷酸化蛋白功能及相關(guān)影響因子的研究有助于深入理解精子獲能的發(fā)生、超激活運動的維持、頂體反應(yīng)的發(fā)生及精卵結(jié)合等受精過程的分子調(diào)控機理。為此,本文綜述了精子獲能前后的變化及已有獲能機制的研究結(jié)果,總結(jié)與分析現(xiàn)有研究的優(yōu)、缺點,為深化獲能機制研究提供參考。1獲能反應(yīng)的因素在雌性生殖道中,精子受到生殖道環(huán)境及去能因子等因素的刺激逐漸發(fā)生獲能反應(yīng),在運動軌跡和質(zhì)膜超微結(jié)構(gòu)及理化特性上都發(fā)生了顯著變化,以適應(yīng)新的環(huán)境并順利完成受精作用。1.1膨脹質(zhì)膜對獲能的影響隨著去能因子的移除,精子膜結(jié)構(gòu)與機能發(fā)生劇烈變化,獲能過程被誘發(fā)。透射電鏡檢測發(fā)現(xiàn),經(jīng)肝素-咖啡因處理的體外獲能牛精子膜發(fā)生了超微結(jié)構(gòu)變化。精子頂體膜囊泡化,頭部核后區(qū)核膜膨脹,并與膨脹的質(zhì)膜相互融合(尾部主段質(zhì)膜膨脹尤為明顯)。由此推測,這些質(zhì)膜的膨脹會導(dǎo)致離子通透性增加,尤其是Ca2+通透性的改變,一方面使得尾部微管滑動,增加了精子拍打的頻率和振幅,導(dǎo)致超激活運動;另一方面Ca2+內(nèi)流促進了蛋白的酪氨酸磷酸化,推動了獲能。電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),獲能后精子頭部側(cè)擺幅度和頻率明顯增加,尾部振幅加大,鞭毛活動頻率加快,運動軌跡偏離線性,呈現(xiàn)超激活運動(HAM)。超激活運動能力的獲得使精子能夠以最快的速度向目標地點運動,為獲能精子順利完成受精過程爭取了時間。1.2能源因子的物理和化學性質(zhì)的變化1.2.1磷酸腺苷的合成獲能前精子以糖酵解為主要能量來源,通過甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)催化3-磷酸甘油醛生成含有高能磷酸基團的1,3-二磷酸甘油酸,并在磷酸甘油醛激酶作用下將高能磷酸基團轉(zhuǎn)移給ADP生成三磷酸腺苷(ATP)。獲能后精子運動加快、代謝增強、耗氧量明顯增加,無氧酵解途徑產(chǎn)生的ATP無法滿足精子對能量的需求,糖酵解和有氧氧化2種供能方式同時啟動。作為運動器官的精子尾,其內(nèi)部線粒體可以氧化磷酸化方式合成大量ATP。ATP合酶(ATPsynthase)位于線粒體內(nèi)膜基質(zhì)側(cè),公認的化學滲透假說認為,底物脫下的氫經(jīng)呼吸鏈傳遞,最終與氧結(jié)合生成水所釋放的能量,在ATP合酶的催化作用下使ADP與pi發(fā)生磷酸化生成ATP。1.2.2頂體酶激活的反應(yīng)伴隨著超激活運動的發(fā)生,獲能精子中很多相關(guān)酶類的活性也發(fā)生了巨大變化。隨著獲能進程,精子腺苷酸環(huán)化酶(Adenylatecyclase,AC)、頂體酶和神經(jīng)氨酸苷酶等相繼被激活。膽固醇流失引起的Ca2+、HCO3-內(nèi)流激活了AC,伴隨著細胞外Ca2+、HCO3-內(nèi)流,胞漿內(nèi)Ca2+也在向線粒體加速內(nèi)流,最終胞漿內(nèi)Ca2+緩慢降低,頂體酶原逐漸活化為頂體酶,激活的頂體酶作用于膜上和膜內(nèi)相關(guān)成分,觸發(fā)了后續(xù)的一系列獲能相關(guān)反應(yīng)。其中,酸性磷酸酶(Acidphosphatase,ACP)是精子獲能過程中變化最為劇烈的頂體酶類之一,磷酸酶的激活提高了膜脂代謝率,產(chǎn)生大量溶血磷脂,這些溶血磷脂代謝產(chǎn)生的甘油二脂可激活蛋白激酶,通過調(diào)控PTP影響精子獲能。S.Mack等的體外獲能研究表明,獲能后4h,ACP活性比獲能前降低了2倍,但其他頂體酶類活性并無明顯變化。然而獲能后ACP活性降低的原理并不清楚。也有研究證明,獲能過程中神經(jīng)氨酸苷酶也被激活,而抑制獲能的磷酸二酯酶的活性則被抑制,導(dǎo)致胞內(nèi)cAMP含量升高,觸發(fā)了精子細胞內(nèi)獲能相關(guān)蛋白的磷酸化,進而促進了精子獲能。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GSTs-mu)家族對獲能的影響正在成為近幾年研究的熱點。研究發(fā)現(xiàn),冷凍導(dǎo)致假獲能精子增多,同時GSTs-mu5表達增強,而同類研究表明,GSTs-mu5促進了小鼠和倉鼠精子的酪氨酸磷酸化,GSTs家族另一成員GSTs-mu3促進了牛、羊精子獲能過程相關(guān)蛋白的酪氨酸磷酸化,同時,該研究推測,GSTsmu3的磷酸化對平衡獲能過程中精子代謝產(chǎn)生的活性氧有重要作用。1.2.3na+/k+atpase抑制劑伴隨著去能因子的去除,Ca2+、HCO3-、K+、Cl-等離子通道相繼被激活,誘發(fā)了相關(guān)離子頻繁的跨膜轉(zhuǎn)運,啟動了精子獲能。因為哺乳動物精子獲能表現(xiàn)出Ca2+依賴性,Ca2+在精子獲能過程中起著重要作用,所以,在眾多精子獲能相關(guān)離子中,Ca2+變化備受關(guān)注。1981年,對海膽的研究發(fā)現(xiàn),獲能精子線粒體內(nèi)Ca2+含量升高,K+含量降低,這種變化增強了精子線粒體內(nèi)的氧化磷酸化偶聯(lián)作用,使得產(chǎn)能增加,提高了精子的運動能力。Na+通道也是精子膜上重要的陽離子通道,廣泛參與了哺乳動物精子獲能。普遍存在于細胞膜上的Na+/K+ATPase(也稱Na+-K+泵)以主動運輸?shù)男问狡毡榇嬖谟诩毎ど?每水解1個ATP可以輸送3個Na+到胞外,同時輸送2個K+入胞,實現(xiàn)了2種離子的主動運輸。研究發(fā)現(xiàn),當精子頭部膜上的Na+/K+ATPase與其抑制劑烏苯苷結(jié)合時,可誘導(dǎo)PTP、精子膜去極化促進精子獲能,這說明Na+/K+ATPase與哺乳動物精子獲能間存在密切關(guān)系,但是,Na+/K+AT-Pase抑制劑的結(jié)合卻抑制精子活力,這與上述促進獲能反應(yīng)的研究結(jié)果相矛盾,所以關(guān)于鈉通道及鈉泵在獲能中的作用尚有待于進一步研究證實。獲能過程中Na+外流,K+內(nèi)流,而Cl-在胞體外配體門控和電壓門控2個Cl-通道的誘發(fā)下發(fā)生內(nèi)流,并且Cl-內(nèi)流是調(diào)控cAMP/PKA(蛋白激酶A)信號通路的上游事件,是必不可少的。精子中存在的電壓依賴性陰離子通道(VDAC)蛋白,可能在精子運動、獲能和頂體反應(yīng)等生理活動中發(fā)揮重要作用。VDAC家族包含VDAC1~33個亞型。VDAC2和VDAC3位于精子的線粒體外鞘和致密纖維上,參與ATP運輸及能量代謝,為精子超激活運動提供能量。研究表明,獲能過程中,VDAC會發(fā)生酪氨酸磷酸化,促進精子獲能,而阻斷該通道,精子會失去運動能力。VDAC呈現(xiàn)敏感的電壓依賴性,可作為離子通道蛋白調(diào)節(jié)線粒體膜對離子和小分子的通透性。膜電壓接近零時,該通道處于完全開放狀態(tài),允許Cl-、K+、Ca2+、Na+、ATP等通過線粒體膜,而當電壓>20mV時,該通道則處于關(guān)閉狀態(tài),通過電壓依賴特性,該通道蛋白實現(xiàn)了對精子獲能的調(diào)節(jié)。上述研究結(jié)果表明,各種離子流動與獲能的關(guān)系還不很清楚,尤其是Na+的流動、Ca2+在細胞內(nèi)外及線粒體間的流動及其引起的相關(guān)功能改變還備受爭議,因此,對各種離子通道及相互關(guān)系的深入研究是揭示獲能機制的又一重要內(nèi)容。2酪氨酸磷酸化系統(tǒng)信號通路、對獲能為揭示精子獲能本質(zhì)、提高體外受精效率,精子獲能機制成為本領(lǐng)域研究焦點,并且取得了一定進展,現(xiàn)已知膽固醇、活性氧等物質(zhì)的存在狀態(tài)和數(shù)量的改變對誘發(fā)獲能反應(yīng)起到了重要作用,并受到多種酪氨酸磷酸化相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié),對這一系列理化過程的理解,為深入闡明獲能機制提供了基礎(chǔ)。2.1白bsa調(diào)節(jié)精子膜膽固醇流失膽固醇外流引起精子膜流動性改變、膜脂類發(fā)生重排及膽固醇/磷脂比率下降。質(zhì)膜膜相的改變,使質(zhì)膜通透性增加,誘發(fā)了Ca2+、HCO3-內(nèi)流,并使胞內(nèi)pH升高,觸發(fā)并促進了獲能,最終使精子處于超激活運動狀態(tài)。研究表明,HCO3-存在情況下,牛血清白蛋白(BSA)能以濃度依賴方式刺激精子膜膽固醇外流,增加精子質(zhì)膜流動性,誘導(dǎo)獲能反應(yīng)。此外,BSA還可通過形成低水平氧自由基促進獲能。甲基-β-環(huán)狀糊精(MBCD)也可代替BSA引起精子膜膽固醇外流,并通過cAMP/PKA途徑促進PTP,最終促進精子獲能。此外,MBCD還可直接促使相關(guān)蛋白發(fā)生PTP,提高精子獲能效率。所以,控制精子質(zhì)膜膽固醇的含量,不僅可調(diào)節(jié)精子生存力,還可通過調(diào)控PTP控制精子獲能狀態(tài)。不同于體外獲能,生理狀態(tài)的膽固醇外流是在雌性生殖道內(nèi)觸發(fā)的,去能因子和其他信號分子的作用及其與Ca2+和HCO3-作用的關(guān)系,還不得而知,有待進一步探索。目前,雌雄生殖道內(nèi)均發(fā)現(xiàn)有載脂蛋白A1、J和高密度脂蛋白等膽固醇受體,但介導(dǎo)膽固醇由精子膜外流至其受體蛋白的轉(zhuǎn)運體還不清楚,對這些轉(zhuǎn)運體的研究將有利于破解膽固醇外流之謎。2.2透皮爾斯地區(qū)獲能機理、政策及藥物的作用關(guān)于獲能與蛋白磷酸化關(guān)系的研究表明,蛋白磷酸化主要發(fā)生在絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)殘基上,但這3種蛋白磷酸化形式中,酪氨酸磷酸化與精子獲能密切相關(guān)。酪氨酸磷酸化首先發(fā)生在精子尾部,隨獲能的進行由尾部向頭部擴散。同時,AKAP蛋白家族成員AKAP3、AKAP4及PHGPx、P32、PDHA等獲能相關(guān)蛋白的磷酸化程度與獲能呈現(xiàn)時間依賴性。關(guān)于信號傳導(dǎo)的研究表明,精子中可能存在3種PTP信號傳導(dǎo)途徑,即可溶性AC/cAMP/PKA途徑、受體酪氨酸蛋白激酶途徑和非受體酪氨酸蛋白激酶途徑,其中第1種途徑最為重要。該信號傳遞路徑:Ca2+、HCO3-等信號分子→可溶性AC激活→cAMP含量增加→PKA被PKA錨定蛋白(AKAPs)募集并活化---→蛋白酪氨酸激酶激活→蛋白酪氨酸磷酸化→精子獲能。但是,還有觀點認為這一信號傳導(dǎo)途徑是通過絲/蘇氨酸蛋白而起作用的,也就是PKA被激活后,首先誘發(fā)獲能相關(guān)蛋白絲/蘇氨酸殘基的磷酸化,并激活酪氨酸激酶,使酪氨酸殘基磷酸化,最終使精子發(fā)生超激活運動、頂體反應(yīng)等獲能相關(guān)事件。研究證實,鼠精子獲能期間PKA活性增加,PKA活性精確地反映了細胞內(nèi)cAMP的濃度變化,而cAMP不但受AC的調(diào)節(jié),還受Ca2+、鈣調(diào)素和HCO3-的調(diào)控,表明cAMP、Ca2+、鈣調(diào)素、HCO3-在不同層面都與PTP密切相關(guān)。獲能液中加入cAMP激動劑而不加Ca2+、HCO3-時,精子發(fā)生超激活運動、PTP及獲能反應(yīng),但未達到加入Ca2+、HCO3-的水平,說明除cAMP/PKA信號通路外,Ca2+、HCO3-還通過其他途徑調(diào)控精子PTP及獲能。但有觀點認為,胞外Ca2+對PTP有抑制作用,這種抑制作用是通過降低胞內(nèi)ATP利用率而實現(xiàn)的。從Ca2+分布看,獲能前精子頭部質(zhì)膜上Ca2+顆粒多呈集團分布,獲能后呈均勻分布,且數(shù)量比獲能前少,說明誘發(fā)獲能時發(fā)生了Ca2+內(nèi)流,這種鈣離子內(nèi)流降低了膜表面高濃度鈣離子導(dǎo)致的PTP抑制效應(yīng)。而Ca2+/鈣調(diào)素(或鈣調(diào)蛋白)對獲能及相關(guān)事件的調(diào)節(jié)作用是雙向的,既可通過AC增加cAMP合成,還能通過環(huán)核苷酸磷酸酶降解cAMP。研究發(fā)現(xiàn),隨獲能進程,胞外HCO3-內(nèi)流增加和同時發(fā)生的Na+/H+交換,使精子細胞內(nèi)pH逐漸升高,HCO3-的內(nèi)流促進了cAMP的生成,進而促進了PTP進程。Ca2+是促發(fā)PTP的關(guān)鍵,所以Ca2+很早就成為獲能機理研究的焦點,但隨著研究的逐漸深入,其在獲能中的作用卻倍受爭議。雖然大多數(shù)學者認為獲能過程中胞內(nèi)Ca2+濃度增加,但也有部分學者認為此過程胞內(nèi)Ca2+濃度保持不變。同時HCO3-的內(nèi)流也對促進獲能具有重要作用,2種離子在獲能過程中的相互關(guān)系尚不明了,它們的作用可能會因為物種或者精子細胞所處環(huán)境的不同而異。所以,改變細胞環(huán)境或許可通過調(diào)節(jié)這2種離子內(nèi)流促進PTP,進而促進精子獲能。2.3ros,ptp的激活生精細胞及成熟精子細胞上存在低電壓調(diào)節(jié)的Ca2+-T型通道,該通道可在低膜電位時協(xié)助Ca2+跨膜轉(zhuǎn)運,為低閾值電壓依賴性通道。未獲能精子細胞膜去極化,Ca2+-T通道失活,抑制未獲能精子發(fā)生自發(fā)頂體反應(yīng)。獲能過程伴隨著膜電位超極化,促使Ca2+-T通道打開,胞外Ca2+內(nèi)流。I.A.Demarco等提出精子膜上存在Na+-HCO-3協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白,HCO-3可直接誘導(dǎo)精子膜的超極化且是Na+依賴性的,但是激活Na+-HCO-3協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白的上游信號還不清楚。研究表明,精子膜超極化可活化環(huán)核苷酸門控通道(環(huán)腺苷酸和環(huán)鳥苷酸均可增強該通道的活性),從而引起膜去極化,導(dǎo)致Ca2+通道開放和胞內(nèi)Ca2+升高。這些變化啟動了與PTP相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而調(diào)節(jié)精子獲能?；钚匝跏蔷友趸磻?yīng)的副產(chǎn)物,正常情況下,可由抗氧化酶直接清除,當ROS水平超過細胞內(nèi)抗氧化酶清除能力時,ROS就會腐蝕精子膜表面的多元不飽和脂肪酸,對精子產(chǎn)生毒害作用。當精液中死精子增加時,過量的ROS和精液中的白蛋白可誘發(fā)精子質(zhì)膜發(fā)生過氧化反應(yīng),降低膜流動性,不利于精子獲能,并使精子活動能力降低甚至喪失,抑制受精過程。但是,阻斷ROS生成后,人精子無法實現(xiàn)獲能,說明ROS是獲能所必須的。在獲能初期O2-較高,之后緩慢降低至較低水平,甚至比未獲能精子水平還低。在獲能后45min出現(xiàn)的ROS波峰正好對應(yīng)精子頭部和尾部發(fā)生PTP的時間,說明R