反相高效液相色譜法測(cè)定大黃、大黃浸膏、清胃顆粒劑中成分

反相高效液相色譜法測(cè)定大黃、大黃浸膏、清胃顆粒劑中成分

清胃粒劑是一種新型的三種中藥制劑，包括單味中藥大黃。具有清胃、除惡解毒、收縮止血的功效。它對(duì)食欲不振、腫脹和惡心也很有效。大黃的化學(xué)成分復(fù)雜,其中蒽醌類(lèi)化合物是重要的活性成分之一。劉玉琦等、王友京等和錢(qián)耀賢等已分別從實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍病理形態(tài)學(xué)特征、腦內(nèi)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)變化及大黃醇提片臨床藥理學(xué)研究中推測(cè),游離蒽醌是可能起主要作用的有效成分;茍奎斌等通過(guò)體外試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí),大黃游離蒽醌對(duì)幽門(mén)螺桿菌具有較強(qiáng)的抑制活力。為了有效地控制大黃清胃顆粒劑產(chǎn)品質(zhì)量,保證臨床用藥合理有效,本文建立了適合大黃藥材、大黃浸膏和清胃顆粒劑中游離蒽醌蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚同時(shí)測(cè)定的反相高效液相色譜(RP—HPLC)定量分析方法,為大黃清胃顆粒劑生產(chǎn)過(guò)程質(zhì)量控制提供有效的檢測(cè)手段。1藥物、藥品和清胃顆粒高效液相色譜儀:Waters510高壓輸液泵、Waters486可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器、島津CR—6A色譜數(shù)據(jù)處量機(jī)。蘆薈大黃素(Aloe-emodin)、大黃素(Emodin)、大黃酸(Rhein)、大黃酚(Chrysophanol)和大黃素甲醚(Physcion)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所,經(jīng)RP—HPLC分離鑒定均為單一色譜峰。大黃藥材購(gòu)自甘肅禮縣,經(jīng)中國(guó)藥科大學(xué)生藥教研室鑒定為正品掌葉大黃(RheumpalmatumL.)。大黃浸膏及清胃顆粒劑由南京空軍醫(yī)院制劑室提供,其中清胃顆粒劑規(guī)格為每包12g,含生藥6g。實(shí)驗(yàn)所用試劑甲醇、高氯酸、乙醇、無(wú)水乙醚等均為國(guó)產(chǎn)分析純,水為二次蒸餾水。2方法和結(jié)果2.1柱溫2.2%vfm檢測(cè)波長(zhǎng)7.色譜柱:YWG—ODS10μm(200×4.0mmID)不銹鋼柱,流動(dòng)相:甲醇—水—高氯酸(75∶25∶0.1V/V),檢測(cè)波長(zhǎng)254nm,靈敏度0.02aufs,流速1.0ml/min,柱溫控制20℃,進(jìn)樣量20μl。圖1為大黃清胃顆粒劑樣品RP—HPLC分離典型譜圖,其中蘆薈大黃素tR6.23min、大黃素tR9.65min、大黃素tR16.50min、大黃酚tR25.41min、大黃素甲醚tR45.03min。2.2提取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液精密稱(chēng)取游離蒽醌蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品各約20.0mg,分別置于五個(gè)25ml棕色量瓶中,加入甲醇超聲溶解,定容制成標(biāo)準(zhǔn)貯備液。依次精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)貯備液各4.0ml置于另一25ml棕色量瓶中,加入甲醇至刻度,混勻制成混合標(biāo)樣。混合標(biāo)樣通過(guò)甲醇稀釋配制成含游離蒽醌蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚各約2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128.0μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液20μl進(jìn)樣分析,以游離蒽醌各組分的色譜峰面積(A)對(duì)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(C)進(jìn)行線性回歸,計(jì)算回歸方程,即蘆薈大黃素A1=3.654×104C+1628,r=0.9992(n=5);大黃酸A2=3.072×104C+2413,r=0.9997(n=5);大黃素A3=3.316×104C-802.7,r=2.134×104+695.6,r=0.9992(n=5)。2.3天麻清胃顆粒劑萃取大黃藥材干燥切片,粉碎并過(guò)60目篩,在60℃下烘3h后取出,置干燥器中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。精密稱(chēng)取大黃藥材6g,加70%乙醇60ml浸漬14h后加熱回流80min,過(guò)濾提取液,制得相應(yīng)的大黃藥材樣品液。精密稱(chēng)取大黃浸膏2.4g(相當(dāng)于大黃生藥6g),加70%乙醇60ml超聲溶解,過(guò)濾,制得相應(yīng)的大黃浸膏樣品液。取不同批號(hào)的大黃清胃顆粒劑試生產(chǎn)樣品各5包,混合后研細(xì)。精密稱(chēng)取12g,加70%乙醇60ml加熱回流30min,過(guò)濾提取液,制得相應(yīng)的大黃清胃顆粒劑樣品液。精密吸取各待測(cè)樣品液1.0ml,水浴60~70℃減壓揮干溶劑后,加二次蒸餾水5.0ml渦旋振搖溶解,3500rpm離心5min。精密吸取上清液1.0ml置于分液漏斗中,加無(wú)水乙醚10ml一次萃取(振搖3min,放置5min)。乙醚萃取液氮?dú)饬飨聯(lián)]干,殘留物用RP—HPLC流動(dòng)相溶解,3500rpm離心5min后取上清液20μl進(jìn)樣分析,由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算大黃藥材、大黃浸膏及清胃顆粒劑樣品液中游離蒽醌各組分的含量,結(jié)果見(jiàn)表1。2.4加樣回收率試驗(yàn)精密稱(chēng)取已知含量的大黃清胃顆粒劑細(xì)粉12g,準(zhǔn)確加入一定量五種游離蒽醌混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按“樣品定量分析”項(xiàng)下方法操作,計(jì)算大黃清胃顆粒劑中游離蒽醌的加樣回收率,具體結(jié)果列于表2,其中蘆薈大黃素為95.61%(n=5),RSD3.05%;大黃素為98.03%(n=5),RSD2.77%;大黃酸為100.1%(n=5),RSD2.21%;大黃酚97.49%(n=5),RSD3.64%;大黃素甲醚為96.79%,RSD4.12%。2.5天麻清胃份液中游離,黃素的表達(dá),是穩(wěn)定性分精密吸取濃度為32.0μg/ml的五種游離蒽醌混合標(biāo)準(zhǔn)溶液20μl,重復(fù)進(jìn)樣5次,結(jié)果求得蘆薈大黃素保留時(shí)間RSD1.12%,峰面積RSD1.98%;大黃素保留時(shí)間RSD1.25%,峰面積RSD2.03%;大黃酸保留時(shí)間RSD1.06%,峰面積RSD2.18%;大黃酚保留時(shí)間RSD1.48%,峰面積RSD2.25%;大黃素甲醚保留時(shí)間RSD2.08%,峰面積RSD2.58%。精密稱(chēng)取同一批大黃清胃顆粒劑細(xì)粉12g共5份,按“樣品定量分析”項(xiàng)下步驟平行制備待測(cè)樣品濃集液,RP—HPLC連續(xù)進(jìn)樣分離分析其中五種游離蒽醌的含量,結(jié)果大黃清胃顆粒劑中游離蒽醌蘆薈大黃素濃度RSD2.85%;大黃素濃度RSD2.61%;大黃酸濃度RSD2.38%;大黃酚濃度RSD3.17%;大黃素甲醚濃度RSD3.68%。3中藥制劑質(zhì)量控制RP—HPLC已成為大黃及其中成藥制劑中蒽醌成分含量測(cè)定的常用方法。本文選擇國(guó)產(chǎn)YWG—ODS10μm(200×4.0mmID)色譜柱,以甲醇—水—高氯酸(75∶25∶0.1V/V)為流動(dòng)相,254nm通用波長(zhǎng)檢測(cè),實(shí)現(xiàn)了大黃清胃顆粒劑中五種游離蒽醌成分的基線分離?？赡苁菄?guó)產(chǎn)填料與進(jìn)口填料色譜性能的差異,使大黃素甲醚的保留時(shí)間相對(duì)較大。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本文建立的定性定量大黃藥材、大黃浸膏及清胃顆粒劑中五種游離蒽醌成分的RP—HPLC方法,實(shí)用方便、定量準(zhǔn)確、檢測(cè)靈敏,適用于大黃清顆粒劑生產(chǎn)過(guò)程的質(zhì)量控制。作為一味具有瀉下作用的中藥材,大黃及其中成藥中蒽醌成分的檢測(cè)結(jié)果多為總蒽醌含量,故樣品制備一般采用酸水解處理。而大黃清胃顆粒劑的質(zhì)量控制,由于其藥理活性成分已多方證實(shí)為游離蒽醌成分,且大鼠幽門(mén)結(jié)扎型胃潰瘍模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步反映了其臨床治療價(jià)值,因此本文對(duì)于大黃清胃顆粒劑包括其生產(chǎn)原料大黃藥材及過(guò)程產(chǎn)品大黃浸膏的定量分析均延用大黃清胃顆粒劑活性成分提取工藝來(lái)操作,RP—HPLC直接測(cè)定其中五種游離蒽醌成分的含量來(lái)表征產(chǎn)品的真實(shí)質(zhì)量。同時(shí),為了避免大黃清胃顆粒劑提取液共存雜質(zhì)的干擾,選用無(wú)水乙醚一次萃取以純化分析樣品,使RP—HPLC分離基線平直,分離結(jié)果良好。中藥制劑的質(zhì)量控制涉及到中藥材品質(zhì)優(yōu)劣及其生產(chǎn)的全過(guò)程。清胃顆粒劑選用優(yōu)