刺血療法治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的臨床研究

刺血療法治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的臨床研究

生理性疼痛是由酪氨酸代謝紊亂和排尿減少引起的一組疾病引起的。急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是痛風(fēng)患者的最常見(jiàn)的首發(fā)癥狀。由于寒冷、飲酒過(guò)量、飲食無(wú)度等原因致使血清尿酸值發(fā)生波動(dòng),從而引起的痛風(fēng)急性發(fā)作,臨床以受累關(guān)節(jié)紅腫熱痛,不能忍受,關(guān)節(jié)活動(dòng)受限為特征［１］。根據(jù)2012年的美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)治療和預(yù)防痛風(fēng)的指南［２］,急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的治療是以秋水仙堿及非甾體抗炎藥的應(yīng)用為主。目前西藥治療本病雖然有一定的療效,但副作用及不良反應(yīng)較多,使患者難以堅(jiān)持［３］。臨床已有相當(dāng)數(shù)量的刺血療法治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的文獻(xiàn)報(bào)道。包括藏醫(yī)在內(nèi)的其他民族醫(yī)學(xué)中的刺血療法報(bào)道也提示刺血療法治療本病有操作簡(jiǎn)單、療效佳、起效快、副作用少的優(yōu)勢(shì)［４－６］。有關(guān)刺血療法治療本病的效應(yīng)機(jī)制和作用機(jī)制尚缺乏深入探討,難以為臨床推廣提供可靠的科學(xué)依據(jù)。為此,科學(xué)設(shè)計(jì)和深入研究實(shí)屬必要。我們擬對(duì)比觀察刺血療法對(duì)于急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的局部癥狀、光鏡下形態(tài)學(xué)改變、電鏡下超微結(jié)構(gòu)改變的影響,初步探索刺血療法治療本病的效應(yīng)機(jī)制。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠(200±20)g,雄性40只,由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供(許可證號(hào):SCXK2010-0001),單籠飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,室溫22~25℃,12/12h晝夜節(jié)律,自由進(jìn)食與飲水,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。1.1.2主要試劑尿酸鈉(美國(guó)sigma公司生產(chǎn),批號(hào):BCBF1330V)。布洛芬混懸液(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn),國(guó)藥準(zhǔn)字:H19980017),布洛芬含量為20mg/mL。1.1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器透射電鏡(日本產(chǎn)JEM-1010)1.2術(shù)后處理和隨訪1.2.1尿酸鈉溶液制備稱取0.2g尿酸鈉,充分研磨,加入4mL無(wú)菌生理鹽水,制成5%尿酸鈉混懸液,超聲(KQ_500B)振蕩混勻。1.2.2大鼠分組使用隨機(jī)數(shù)字表將40只大鼠隨機(jī)分成4組,分別為正常組10只,模型組10只,布洛芬組10只,刺血組10只。1.2.3模型制備方法使用10%水合氯醛,以0.35mL/100g的劑量對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉。正常組不處理,其他3組大鼠均將右后肢踝關(guān)節(jié)擺放成直角,充分暴露出踝關(guān)節(jié)與脛腓骨之間的間隙,以45°角從該間隙直插入右后肢背側(cè)正中踝關(guān)節(jié)與脛腓骨之間的關(guān)節(jié)腔。造模的3組均用4號(hào)針頭進(jìn)行關(guān)節(jié)腔注射,每次注射前均以75%的酒精消毒。1.2.4治療干預(yù)正常組、模型組不做任何治療性干預(yù);藥物組分別于造模后6、24h以布洛芬120mg/kg［７］灌胃;刺血組分別于造模后6、24h在右側(cè)昆侖穴(后肢外踝與跟腱之間的凹陷中)［８］,用0.7mm注射器針頭點(diǎn)刺放血(深度約為0.3cm),以自然停止出血為度(先測(cè)量關(guān)節(jié)周徑再治療)。1.2.5關(guān)節(jié)局部癥狀觀察正常組、模型組、藥物組、刺血組在造模前、造模后6、24、48h分別用2~3mm的紙條測(cè)量造模踝關(guān)節(jié)的周徑,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)測(cè)量3次,取平均值［９］。1.2.6光鏡病理切片的制備與觀察造模48h后處死大鼠,每組隨機(jī)各取5只,剪取右后肢踝關(guān)節(jié)(近端和遠(yuǎn)端各保留0.5cm),去皮,以10%甲醛固定24h,后用10%硝酸脫鈣3d,每天更換硝酸,完全脫鈣后梯度酒精脫水,石蠟包埋,切片(厚4μm),常規(guī)HE染色觀察局部關(guān)節(jié)腔形態(tài)學(xué)改變。1.2.7電鏡標(biāo)本的制備與觀察造模48h后每組隨機(jī)各取2只,剪取右后肢踝關(guān)節(jié)腔附近的關(guān)節(jié)軟骨,固定于5%的戊二醛中。在4℃冰箱中固定24h后,用PBS沖洗4次,把關(guān)節(jié)軟骨放置于10%的鋨酸中放置在4℃冰箱2h,用PBS再?zèng)_洗2次,用2%醋酸鈾塊染2h,梯度酒精脫水,浸染樣本,包埋,聚合。透射電鏡下觀察制作好的樣本。1.2.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以u(píng)e003±s表示。組內(nèi)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);組間比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1各組大鼠患下肢關(guān)節(jié)周徑、周徑變化情況比較由表1可知,正常組4個(gè)時(shí)間點(diǎn)關(guān)節(jié)周徑比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組、藥物組、刺血組造模6h與其造模前周徑比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說(shuō)明造模成功。模型組造模后24h與造模后6h比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說(shuō)明大鼠的造模關(guān)節(jié)周徑在6h至24h持續(xù)腫脹,局部癥狀加重;造模后48h關(guān)節(jié)周徑分別與造模后6、24h比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),說(shuō)明造模后大鼠患肢關(guān)節(jié)局部癥狀穩(wěn)定,自愈現(xiàn)象不明顯。藥物組造模后24h與造模后6h比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),表明布洛芬給藥早期(24h內(nèi))消除關(guān)節(jié)腫脹的效果不明顯;造模后48h與造模后6h比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明布洛芬給藥24h后能改善關(guān)節(jié)局部癥狀,消除關(guān)節(jié)腫脹。刺血組造模后24、48h的關(guān)節(jié)周徑分別與造模后6h比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明刺血療法能有效改善關(guān)節(jié)局部癥狀,消除關(guān)節(jié)腫脹,有起效快、療效持續(xù)的優(yōu)點(diǎn)。造模前各組右后肢踝關(guān)節(jié)周徑比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模后6h各組間比較,造模干預(yù)的3組與正常組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。造模后24h各組間比較,刺血組與模型組、藥物組比較,周徑明顯減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與正常組比較,關(guān)節(jié)周徑無(wú)顯著性差異(P>0.05)。造模后48h刺血組、藥物組與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。藥物組、刺血組與正常組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2.2尿酸鈉結(jié)晶沉積正常組的切片顯示關(guān)節(jié)腔中未見(jiàn)滲出液,未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn),關(guān)節(jié)表面光滑,無(wú)缺損;模型組的切片顯示關(guān)節(jié)腔內(nèi)有尿酸鈉結(jié)晶沉積(粉色團(tuán)塊狀物體),并有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn);藥物組的切片顯示關(guān)節(jié)腔內(nèi)有部分尿酸鈉結(jié)晶沉積(粉色團(tuán)塊狀物體),并有部分炎細(xì)胞浸潤(rùn);刺血組的切片顯示關(guān)節(jié)腔內(nèi)有少量粉色團(tuán)塊狀物體沉積,及少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。2.3小鼠骨髓組織結(jié)構(gòu)正常4組關(guān)節(jié)軟骨樣本在透射電鏡下觀察,除正常組,其他3組均有不同程度的破壞。正常組細(xì)胞正常,線粒體清楚,膠原纖維排列縱橫交錯(cuò),不具明顯橫紋或聚集成團(tuán)狀;模型組關(guān)節(jié)軟骨樣本顯示其細(xì)胞膜少許破壞,細(xì)胞有滲出,突起,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,膠原纖維排列亂且密集;藥物組關(guān)節(jié)軟骨樣本顯示其細(xì)胞有滲出,突起,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,線粒體漸少,膠原纖維排列紊亂;刺血組關(guān)節(jié)軟骨樣本顯示其細(xì)胞有少量滲出,基本細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,膠原纖維排列較亂。見(jiàn)圖2~3。3布洛芬給藥及刺血療法的聯(lián)合應(yīng)用療效中醫(yī)學(xué)認(rèn)為血中瘀熱是急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病關(guān)鍵。本病臨床發(fā)病以受累關(guān)節(jié)紅腫熱痛、活動(dòng)受限為特點(diǎn)。刺血療法善治熱證、實(shí)證、痛癥、急癥,具有清熱、止痛、消腫、祛瘀的直接治療作用,治療本病則更具優(yōu)勢(shì),且符合“菀陳則除之”、“血實(shí)宜決之”、“熱則疾之”的針灸治療原則。從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,使用尿酸鈉關(guān)節(jié)腔注射能較好的復(fù)制急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型,關(guān)節(jié)腫脹明顯,癥狀能持續(xù)48h且無(wú)自愈現(xiàn)象。布洛芬作為非甾體類抗炎藥,給藥后能一定程度減輕炎癥反應(yīng),消除腫脹,縮小關(guān)節(jié)周徑,但起效時(shí)間較晚(給藥18h后起效)。使用點(diǎn)刺放血后,大鼠模型關(guān)節(jié)周徑縮小明顯,說(shuō)明刺血療法對(duì)本病有較好的抗炎消腫作用,起效迅速(刺血后即起效)。各組光鏡下觀察右后肢踝關(guān)節(jié)形態(tài)學(xué)改變可知,急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎會(huì)有尿酸鈉晶體沉積關(guān)節(jié)腔,并伴有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。布洛芬給藥及刺血療法,均能使關(guān)節(jié)腔內(nèi)尿酸鈉晶體及炎細(xì)胞減少。其中,刺血療法對(duì)于尿酸鈉晶體沉積及炎細(xì)胞浸潤(rùn)的治療效果更好。各組透射電鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨超微結(jié)構(gòu)可知,急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎對(duì)于關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞及膠原纖維的損害較大。布洛芬給藥及刺血療法均能改善尿酸鈉對(duì)關(guān)節(jié)軟骨超微結(jié)構(gòu)的損害,且刺血療法的改善作用更明顯。尿酸鹽結(jié)晶對(duì)關(guān)節(jié)腔