登革2型病毒prme基因在畢赤酵母中的表達(dá)及鑒定

登革2型病毒prme基因在畢赤酵母中的表達(dá)及鑒定

感染登格病毒（denv）包括四種類型的血液（denv-1、denv-2、denv-3和denv-4），屬于黃毒科和黃毒科。DENV感染人體后,可引起登革熱(denguefever,DF)和登革出血熱(denguehemorrhagicfever,DHF)/登革休克綜合癥(dengueshocksyndrome,DSS)。根據(jù)WHO統(tǒng)計(jì),全世界每年約有5千萬～1億的人感染DENV,其中約近7萬的人因感染DENV而死亡,大多是15歲以下的兒童。目前,世界上尚無可有效預(yù)防登革熱的疫苗和相應(yīng)的治療藥物。黃病毒的基因組為單股正鏈RNA,分子量約為11kb。病毒基因組RNA編碼核蛋白(capsid,C)、膜蛋白(membrane,prM/M)、包膜蛋白(envelope,E)3種結(jié)構(gòu)蛋白和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1,NS2a,NS2b,NS3,NS4a,NS4b,NS5)。其中,prM蛋白在和E蛋白是構(gòu)成病毒顆粒的主要結(jié)構(gòu)蛋白,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中組裝成非感染性的未成熟病毒顆粒。在宿主細(xì)胞的弗林蛋白酶(furin)的作用下,prM被切割為pr和M蛋白,并引發(fā)病毒顆粒表面的E蛋白發(fā)生重排,產(chǎn)生含M蛋白的病毒顆粒。黃病毒的包膜E蛋白與prM蛋白在體外表達(dá)系統(tǒng)中共表達(dá)時(shí),可折疊為類似病毒粒子的正確的空間結(jié)構(gòu)的多聚體顆粒-病毒樣顆粒(Virus-likeparticles,VLPs)也稱作亞病毒顆粒(subviralparticles,SVPs)。通過cryo-EM分析TBEV病毒樣顆粒的分子結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)VLPs含有60個(gè)E蛋白組成的二聚體,呈二十面體結(jié)構(gòu),顆粒的直徑為30nm左右。Schalich等通過對(duì)TBEV的VLP理化特性和生物學(xué)活性進(jìn)行研究后,發(fā)現(xiàn)VLPs不僅含有與病毒粒子類似的雙層脂膜和E蛋白二聚體的表面排列,而且具有相似的prM和E蛋白的加工和糖基化修飾,甚至連抗原的表位也一致。VLPs同樣具有類似成熟病毒顆粒的一些生物學(xué)活性方面,如VLPs能在低pH條件下發(fā)生結(jié)構(gòu)重排,具有HA活性以及與細(xì)胞膜的融合活性等。我們利用組成型表達(dá)的畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)登革2型病毒的prM和E蛋白,并利用透射電鏡技術(shù)對(duì)病毒樣顆粒在酵母細(xì)胞內(nèi)的組裝特性進(jìn)行了初步分析,為研制登革病毒樣顆粒疫苗的基礎(chǔ),同時(shí),病毒樣顆粒也將為研究登革病毒的組裝機(jī)制和生物學(xué)活性提供一個(gè)很好的模型。1材料和方法1.1病毒和細(xì)胞株登革2型病毒(DENV-2)ZS01/01株由本實(shí)驗(yàn)室分離并測(cè)定其全基因組序列,提交GenBank,登錄號(hào)為EF051521。1.2宿主gs115大腸桿菌(E.Coli)DH5α和巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)宿主GS115均由本實(shí)驗(yàn)室保存。畢赤酵母表達(dá)載體pGAPZαA為Invitrogen公司產(chǎn)品,含組成型表達(dá)啟動(dòng)子GAP,釀酒酵母α-factor分泌信號(hào)肽編碼序列,以及作為選擇標(biāo)記的編碼Zeocin抗生素的抗性基因。1.3菌株和抗登革藥的制備逆轉(zhuǎn)錄酶(ReverseTranscriptase),EXTaq酶和各種限制性內(nèi)切酶均為大連寶生物工程(Takara)公司產(chǎn)品。TRIzol和Zeocin抗生素為Invitrogen公司的產(chǎn)品?？沟歉?型E蛋白的單克隆抗體(3H5-1)購(gòu)自美國(guó)ATCC。鼠源抗登革2型病毒血清由本實(shí)驗(yàn)室自制。1.4重組質(zhì)粒pgaprad-pcr的構(gòu)建1.4.1引物設(shè)計(jì)擴(kuò)增含prM信號(hào)肽序列的包膜蛋白基因(SprME)的上游引物為DY1(5′-GACTTCGAAAATGAACATCTTGAACAGGAG-3′),斜體字部分為Bsp119Ⅰ酶切位點(diǎn),下劃線部分代表ATG起始密碼子。下游引物為DY2(5′-GAATCTAGATCAGGCCTGCACCATGACTC-3′)斜體字部分為XbaⅠ酶切位點(diǎn),下劃線部分代表終止密碼子。所有引物均在PrimerPremier5軟件上設(shè)計(jì),由廣州英駿公司合成。1.4.2登革病毒RNA的抽提與RT-PCR將DENV-2ZS01/01病毒株接種C6/36細(xì)胞單層上,加入含2%滅活小牛血清的MEM培養(yǎng)液,于37℃培養(yǎng)至出現(xiàn)細(xì)胞病變?yōu)椤?++”,收集上清進(jìn)行RNA的制備。RNA的制備的具體方法參照TRIzol抽提試劑盒的說明書。然后以RNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增目的基因,具體操作步驟為:在一無RNA酶的EP管中加入模板RNA(5～10μg),2μL下游引物(DY2),2μLdNTPs(100mmol/L)和3μLDEPC水,將上述成分混勻并在65℃水浴5min,迅速在冰上預(yù)冷2min以上。加入4μL5×PrimeScriptBuffer,1μLRNaseInhibitor(40U/μL),0.5μLReverseTranscriptase(200U/μL)。將上述溶液混勻,在PCR儀上42℃保溫30min,70℃15min;然后將PCR管置于冰上冷卻,得到的cDNA用于PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5min,然后94℃變性1min,55℃退火45s,72℃延伸2min,循環(huán)30次,再在72℃延伸10min。1.4.3重組表達(dá)載體的構(gòu)建將獲得的目的基因SprM和穿梭質(zhì)粒pGAPZαA分別用Bsp119I和XbaI進(jìn)行酶切,并利用E.Z.N.A凝膠回收試劑盒回收所需的基因片段。將酶切回收后的基因片段與pGAPZαA載體在T4DNALigase的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。通過含Zeocin抗生素的LowSaltLB平板(25μg/mL)的篩選獲得轉(zhuǎn)化的陽性克隆菌落。利用E.N.Z.A質(zhì)粒抽提試劑盒抽提陽性菌落的質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR,酶切和測(cè)序鑒定。1.4.4畢赤酵母轉(zhuǎn)化和表達(dá)、鑒定利用BglII酶對(duì)重組質(zhì)粒pGAPZA-SprME進(jìn)行線性化處理,取100μL制備好的畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞,與10μg線性化的DNA混合,轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的0.2cm的電轉(zhuǎn)化杯中,冰浴5min,在Bio-Rad電轉(zhuǎn)化儀中進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化,電脈沖參數(shù)為電壓1500V,5ms。取200μL轉(zhuǎn)化細(xì)胞分別鋪在含有100μg/mLZeocin的YPD平板上,放置在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3d至平板長(zhǎng)出乳白的酵母轉(zhuǎn)化菌落。挑取經(jīng)PCR鑒定為陽性的含有pGAPZA-SprME質(zhì)粒的酵母菌轉(zhuǎn)化子分別接種于3mLYPD液體培養(yǎng)基(100μg/mLZeocin)中,30℃,250r/min的條件下有氧振蕩培養(yǎng)12h。然后按1∶100的比例將菌液接種至100mL新鮮的YPD發(fā)酵培養(yǎng)液中,30℃下,振蕩培養(yǎng),每隔12h取出1mL菌液4℃條件下,10000r/min離心,分別收集上清和菌體。取80μL上清與20μL5×上樣buffer混合,20μL裂解后的菌體與等量的2×上樣buffer混合,在沸水中水浴10min。樣品冷卻后,進(jìn)行SDS,每個(gè)樣品加入兩塊膠相對(duì)應(yīng)的點(diǎn)樣孔。每個(gè)點(diǎn)樣孔加30μL樣品,在120V電壓下電泳2h左右。電泳結(jié)束后,將一塊膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色,相同點(diǎn)樣順序的另一塊膠上的蛋白通過電轉(zhuǎn)移至PVDF膜進(jìn)行Westernblotting檢測(cè)。膜在含0.1%Tween-20和5%脫脂奶粉的TBS中4℃封閉過夜,然后加入適當(dāng)稀釋的抗E單抗(3H5-1)或者抗DENV-2血清,室溫反應(yīng)4h。用含0.1%Tween-20的TBS洗膜3次,每次10～15min。然后加入1∶2000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG二抗溶液。室溫輕輕振蕩溫育2h。用TBST洗膜3次。最后加入DAB溶液顯色。1.4.6病毒樣顆粒的純化取5mL的酵母菌體,加入預(yù)冷的1mLBreakingBuffer(50mmol/LNaH2PO4,1mmol/LPMSF,1mmol/LEDTA,5%glycerol,pH7.4)加入酸洗玻璃珠(Sigma)冰浴條件下裂解細(xì)胞。裂解液在4℃條件下,12000g離心10min。將裂解液上清移至含5%～50%的蔗糖梯度溶液的上層,在4℃153000g的條件下離心6h(HATICHI,P80AT轉(zhuǎn)子)。離心結(jié)束后,取絮狀病毒樣顆粒層進(jìn)行電鏡檢測(cè)。1.4.7電鏡檢測(cè)細(xì)胞透射電鏡觀察:將培養(yǎng)72h的酵母發(fā)酵液,2000r/min離心5min,收集菌體。小心的加入前固定液,切勿沖散管底的菌體。然后送中山大學(xué)電鏡室進(jìn)行包埋,切片等程序,將樣品進(jìn)行電鏡觀察(PhilipsCM10電子顯微鏡,工作電壓40kV),并拍照。免疫電鏡觀察:取90μL蔗糖密度梯度離心后的病毒樣顆粒,用PBS稀釋10倍。加入1∶100稀釋的特異性抗DENV-2病毒血清0.1mL充分混合。置37℃作用1h,后再置4℃過夜。以17000r/min,離心60min。吸去上清,將離心管口倒置于濾紙上,吸去殘留液體,沉淀物中加少量H2O混懸,用2%磷鎢酸(pH7.2)負(fù)染1～2min,滴加于400目銅網(wǎng)Fomnvar膜上,用濾紙從銅網(wǎng)邊緣輕輕吸去多余的負(fù)染液。將樣品進(jìn)行電鏡觀察(PhilipsCM10電子顯微鏡,工作電壓40kV),并拍照。2結(jié)果與分析2.1rt-pcr擴(kuò)增以DENV-2ZS01/01株病毒的RNΑ為模板,利用下游引物DY2進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增得到cDNΑ。然后以cDNΑ為模板用上下游引物DY1/DY2擴(kuò)增SprME片段,PCR產(chǎn)物的大小約為2250bp,與預(yù)期的分子量相符,見圖1。2.2pcr鑒定及其擴(kuò)增將獲得的SprME基因片段通過內(nèi)切酶Bsp119I和XbaI的作用插入pGΑPZαΑ載體的多克隆位點(diǎn),然后在T4連接酶的作用下進(jìn)行連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)Zeocin抗生素篩選后,進(jìn)行PCR鑒定,利用載體通用引物5’pGAPFoward/3’AOXI進(jìn)行擴(kuò)增,可見一條大小約為2300bp的片段,空載體pGΑPZαΑ擴(kuò)增出來的片段大小約為530bp(圖2A);利用基因特異的上下游引物DY1/DY2檢測(cè),可擴(kuò)增出一條大小約為2250bp的片段,而空載體未擴(kuò)增出特異性條帶(圖2B)。最后通過測(cè)序表明含prM/E基因的重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。2.3denv-2e蛋白檢測(cè)將重組質(zhì)粒pGΑPZΑ-SprME電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,通過抗生素Zeocin篩選和PCR鑒定后,進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)。收集不同時(shí)間段的發(fā)酵上清上清分別進(jìn)行SDS-PΑGE電泳和Westernblot檢測(cè)。免疫印跡結(jié)果顯示檢測(cè)52kDa的蛋白可與DENV-2E單抗特異結(jié)合,表明該蛋白就是酵母菌分泌表達(dá)的DENV-2E蛋白(圖3A);利用抗DENV-2血清孵育后,除檢測(cè)到52kDa的E蛋白條帶外,還在約20kDa的位置檢測(cè)到prM蛋白帶(圖3B)。利用凝膠掃描系統(tǒng)分析后發(fā)現(xiàn),E蛋白的分泌表達(dá)量占總蛋白含量的23%左右,見圖4。2.4空泡病毒樣的排列用細(xì)胞透射電鏡觀察表達(dá)病毒樣顆粒的重組酵母菌超微結(jié)構(gòu)。在酵母細(xì)胞的胞漿中形成了一個(gè)大雙層膜的囊泡結(jié)構(gòu),大的囊泡中被同樣由雙層膜結(jié)構(gòu)組成的小室間隔,小室里分布著大量的直徑為50-100nm的空泡(vesiclepackets,VP)。在小室里的聚集30-50nm的病毒樣顆粒(virus-likeparticles,VLPs)以散狀或晶格狀排列(圖5A)。當(dāng)囊泡的外膜破裂后,那些包裹在小室里面的病毒顆粒便被釋放到細(xì)胞漿,見圖5B。2.5免疫電鏡觀察經(jīng)蔗糖密度梯度超速離心后,吸取絮狀的病毒樣顆粒,進(jìn)行免疫電鏡觀察。在抗DENV-2血清的作用下發(fā)生聚集,顆粒的形態(tài)為規(guī)則的球形,直徑約為30-50nm,見圖6。3denv病毒的分離純化病毒樣顆粒(Virus-likeparticles,VLPs)是指由病毒的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白組裝成的,不含病毒核酸,不能進(jìn)行自主復(fù)制的空心顆粒。VLPs不包含病毒DNA或RNA,因此不存在毒力的回復(fù)和同源重組的隱患。同時(shí),VLPs保留了與天然病毒粒子相同或類似的空間構(gòu)型和誘導(dǎo)中和抗體的抗原表位,具有很強(qiáng)的免疫原性。不但能誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫,而且可以激發(fā)CD4+T細(xì)胞的增殖和CTL反應(yīng)。常用的表達(dá)VLPs的系統(tǒng)有桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),酵母表達(dá)系統(tǒng),哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)和腺病毒表達(dá)系統(tǒng)等。其中,釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的HBcAgVLPs和四價(jià)人乳頭狀瘤病毒(Humanpapillomavirus,HPV)VLPs疫苗已經(jīng)通過FDA認(rèn)證。黃病毒樣顆粒的形成離不開E蛋白的正確折疊,以及prM和E的相互作用。黃病毒的prM信號(hào)肽位于在C蛋白的C末端的疏水的區(qū)域,發(fā)揮引導(dǎo)prM進(jìn)入粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能。通過對(duì)共表達(dá)黃病毒的prM和E基因發(fā)現(xiàn),在prM的N端引入prM信號(hào)肽能有效的引導(dǎo)E蛋白以VLPs的形式分泌到上清中。我們通過生物信息學(xué)軟件SingalIP對(duì)DENV-2ZS01/01的C蛋白的C末端進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn),prM的信號(hào)肽序列位于C蛋白的C末端的20-25個(gè)氨基酸殘基序列。并用病毒自身的prM信號(hào)肽取代了pGAPZαA載體的α信號(hào)肽,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在prM信號(hào)肽的引導(dǎo)下包膜E蛋白被高水平的分泌表達(dá)。用組成型表達(dá)的pGAPZαA載體取代傳統(tǒng)的甲醇誘導(dǎo)型表達(dá)載體是本研究的一大亮點(diǎn)。雖然醇氧化酶(alcoholoxidaseI,AOXI)啟動(dòng)子已被成功應(yīng)用并表達(dá)了多種外源蛋白。但使用甲醇誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)存在諸多缺陷,如外源基因的轉(zhuǎn)錄水平受到甲醇的嚴(yán)格調(diào)控和誘導(dǎo),殘留的甲醇對(duì)外源蛋白在食品和藥物應(yīng)用的影響以及發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)不間斷的添加甲醇而帶來的安全隱患等。因此,相比甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子