腦缺血-再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究

腦缺血-再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究

嚴(yán)重缺血后，不僅會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的缺血器官損傷，還會(huì)導(dǎo)致遠(yuǎn)距器官損傷。如果嚴(yán)重，可能會(huì)導(dǎo)致多器官功能衰竭。腦本身缺血-再灌注(ischemia-reperfusion,I-R)損傷的研究倍受重視,但外周器官I(mǎi)-R對(duì)腦有無(wú)損傷作用則缺乏觀察。研究表明,一氧化氮(nitricoxide,NO)介導(dǎo)腦I-R損傷,而誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)是NO過(guò)量生成的基礎(chǔ),iNOS-NO是否作為一種普遍機(jī)制也參與外周器官I(mǎi)-R引發(fā)的腦損傷尚未見(jiàn)報(bào)道。本文通過(guò)復(fù)制后肢I(xiàn)-R的大鼠模型,觀察肢體I-R損傷對(duì)腦的影響,并通過(guò)腦組織iNOSmRNA、iNOS、過(guò)氧亞硝基陰離子(peroxynitriteanion,ONOO-)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)等指標(biāo)的測(cè)定,以期從一個(gè)側(cè)面探討肢體I-R引發(fā)腦損傷的可能機(jī)制。材料和方法1細(xì)胞毒和抗凝劑棲熱水生菌脫氧核糖核酸(thermusaquaticusdeoxyribonucleicacid,TaqDNA)聚合酶(上海生物工程公司)、禽成髓細(xì)胞瘤病毒(avianmyeloblastosisvirus,AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)、iNOS引物(上海生物工程公司)、β-actin引物(北京鼎國(guó)生物公司)、抗iNOS多克隆抗體(SantaCruz)、抗硝基化酪氨酸(nitrotyrosine,NT)單克隆抗體(Cayman)、過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉毒—親和素試劑盒(ZYMED)、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)(Sigma)、MDA、SOD測(cè)定試劑盒(南京聚力生物醫(yī)學(xué)工程研究所)。SD大鼠,河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。2動(dòng)物腦損傷活性及免疫組化染色2.1實(shí)驗(yàn)分組與動(dòng)物模型復(fù)制健康SD大鼠91只,體重200-215g,雌雄不拘。動(dòng)物隨機(jī)分為正常(N)組、假手術(shù)(S)組、后肢單純?nèi)毖?I)組、后肢缺血-再灌注(I-R)2、6、12、18、24h各組。反轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR)實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物24只,每組3例;HE及免疫組化染色實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物20只,只觀察N、S、I、I-R6h4組,每組5例;透射電鏡實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物15只,只觀察N、I、I-R6h3組,每組5例;MDA、SOD測(cè)定實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物32只,只測(cè)定N、S、I、I-R6h4組,每組8例。動(dòng)物在20%烏拉坦(1g.kg-1,ip)麻醉下,暴露腹主動(dòng)脈下段,以無(wú)創(chuàng)性動(dòng)脈夾夾閉腹主動(dòng)脈末端4h、開(kāi)放2-24h分別復(fù)制I、I-R組模型。S組模擬I組手術(shù)過(guò)程但不夾閉血管,術(shù)后10h取腦。N組動(dòng)物麻醉后直接取腦。2.2HE與免疫組化染色動(dòng)物經(jīng)主動(dòng)脈插管灌注固定液(4%多聚甲醛,0.1mol/LPBS配制)后取腦,經(jīng)后固定行石蠟包埋、切片,片厚5-6μm,在大腦連續(xù)冠狀切片中,挑取尾狀核、海馬發(fā)達(dá)部位裱片(這些區(qū)域及皮質(zhì)對(duì)缺血、缺氧等損傷敏感),分別作HE染色及以抗iNOS抗體、抗NT抗體為一抗的免疫組化染色,Olympus萬(wàn)能顯微鏡觀察照像。免疫組化染色步驟為:切片常規(guī)脫蠟入水,3%H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,經(jīng)抗原修復(fù)和正常血清封閉后,依次加入一抗(抗iNOS或抗NT)、二抗工作液、酶標(biāo)鏈霉素-親和素,DAB顯色,棕色產(chǎn)物為陽(yáng)性標(biāo)記。兩種免疫組化染色均設(shè)替代對(duì)照(以PBS代替一抗)。2.3透射電鏡標(biāo)本制備及觀察動(dòng)物經(jīng)灌注固定液(多聚甲醛2%,戊二醛1.25%,0.1mol/LPBS配制)后取腦,以海馬、皮質(zhì)(頂部)為觀察部位行二次取材,經(jīng)后固定、鋨化、脫水后,環(huán)氧樹(shù)脂815包埋,超薄切片,鈾一鉛雙重電子染色,日立H-7500型電鏡觀察攝影。2.4RT-PCR動(dòng)物斷頭快速取腦(皮質(zhì)與海馬),常規(guī)提取腦組織總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備iNOScDNA及內(nèi)參對(duì)照物β-actincDNA。在兩個(gè)相同的PCR體系中對(duì)iNOScDNA片段(430bp)及β-actincDNA片段(540bp)進(jìn)行擴(kuò)增。iNOSPCR條件:94℃45s、50℃45s、72℃45s,循環(huán)35次,72℃10min;β-actinPCR條件:94℃45s、55℃45s、72℃45s,循環(huán)30次,72℃10min。兩種產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定用醫(yī)學(xué)圖像處理系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行灰度及面積掃描。將iNOS條帶的灰度值與β-actin條帶的灰度值的比值作為每例標(biāo)本的iNOSmRNA半定量結(jié)果。2.5腦組織MDA含量、SOD活性測(cè)定動(dòng)物斷頭快速取腦(皮質(zhì)與海馬)制勻漿提上清,按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,全自動(dòng)酶標(biāo)儀(奧地利產(chǎn))測(cè)消光值。MDA含量測(cè)定采用10%腦勻漿上清,其含量單位為μmol/L,SOD活性測(cè)定采用1%腦勻漿上清,其活力單位為103U/L。3統(tǒng)計(jì)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,組間比較采用t檢驗(yàn)。結(jié)果1海馬ca1ca2區(qū)光鏡觀察顯示,S、I組腦組織與N組相比未見(jiàn)異常變化,I-R6h組,大腦皮質(zhì)、丘腦、齒狀回等區(qū)部份神經(jīng)元胞體、胞核增大,胞漿及核密度下降,部分神經(jīng)元核仁消失。大腦皮質(zhì)部分錐體細(xì)胞、海馬CA1區(qū)、CA2區(qū)部分神經(jīng)元胞體明顯變小,著色深,細(xì)胞周?chē)霈F(xiàn)水腫裂隙。海馬各區(qū)放射層纖維紋理紊亂、扭曲。電鏡觀察顯示,I組動(dòng)物腦組織未見(jiàn)明顯異常變化,I-R6h組神經(jīng)元膜相系統(tǒng)受損較重,海馬及皮質(zhì)區(qū)組織中間、毛細(xì)血管周?chē)⑸窠?jīng)元核周可見(jiàn)水腫灶,神經(jīng)元線粒體腫脹,峭紊亂、擴(kuò)大、消失、空泡化,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少,髓鞘板層分離(圖1:A、B,見(jiàn)加頁(yè)Ⅰ)。2細(xì)胞組和抗nt陽(yáng)性標(biāo)記染色抗iNOS抗體標(biāo)記染色顯示,N組腦組織未見(jiàn)iNOS陽(yáng)性細(xì)胞,S、I及I-R6h組腦組織均出現(xiàn)iNOS陽(yáng)性標(biāo)記的神經(jīng)元及小膠質(zhì)細(xì)胞,S、I組陽(yáng)性細(xì)胞分布于皮層后肢區(qū)、尾狀核(傷害性刺激的感受、調(diào)制中樞)區(qū),I-R6h組iNOS陽(yáng)性細(xì)胞分布比S、I組廣泛,見(jiàn)于皮層各區(qū)、海馬、尾狀核等區(qū)?？筃T抗體標(biāo)記染色顯示,I-R6h組皮層、海馬、尾狀核等區(qū)有彌散分布的NT陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞。I組偶見(jiàn)少量NT陽(yáng)性細(xì)胞(圖1:C、D,見(jiàn)加頁(yè)Ⅰ)。3nosmrna表達(dá)量N組未檢出iNOSmRNA,其它各組腦組織均有iNOSmRNA表達(dá),其中,S組表達(dá)較弱,I組較S組增強(qiáng),再灌2h組明顯高于I組,6h表達(dá)量最大,此后衰減,再灌24h仍有少量表達(dá)(圖2、3)。4各組小鼠sod活性的比較I-R6h組MDA含量顯著高于N、S、I組,SOD活性顯著低于這些組;S、I組SOD活性及MDA含量與N組比較無(wú)顯著差異(表1)。研究肢體i-r活性的變化本實(shí)驗(yàn)證實(shí),肢體I-R對(duì)腦組織有損傷作用,其機(jī)制可能涉及:創(chuàng)傷應(yīng)激;夾閉腹主動(dòng)脈引起的血流動(dòng)力學(xué)改變;肢體I-R為始動(dòng)因素,通過(guò)某種機(jī)制引起腦損傷等方面。在本實(shí)驗(yàn)中,S、I組腦組織未出現(xiàn)明顯的病理改變,其MDA含量與N組相比無(wú)顯著差異。另?yè)?jù)BengisunU報(bào)道,夾閉腹主動(dòng)脈引起的血流動(dòng)力學(xué)改變是一過(guò)性的,對(duì)心功能無(wú)明顯影響。我們認(rèn)為,本實(shí)驗(yàn)的手術(shù)創(chuàng)傷及夾閉腹主動(dòng)脈造成的血流動(dòng)力學(xué)改變不是肢體I-R所致腦損傷的重要因素,而I-R6h組MDA含量較N組顯著升高的結(jié)果提示,氧化應(yīng)激可能是肢體I-R所致腦損傷的重要機(jī)制之一。研究證明,NOS-NO參與了腦缺血-再灌注損傷的發(fā)病過(guò)程,高濃度的NO具有神經(jīng)毒性。NO毒性的強(qiáng)弱不僅與濃度有關(guān),還取決于內(nèi)環(huán)境中活性氧的水平。NO與超氧陰離子(O?22?)能快速結(jié)合生成ONOO-,后者的氧化性較NO及O?22?更強(qiáng)。ONOO-能與半胱氨酸、谷胱甘肽之巰基發(fā)生不可逆反應(yīng);能使SOD等活性蛋白的酪氨酸硝基化;還能強(qiáng)烈抑制線粒體的呼吸功能?，F(xiàn)在認(rèn)為,NO的細(xì)胞毒效應(yīng)主要由ONOO-介導(dǎo)。肢體I-R后血液中氧自由基急劇上升,腦組織中包括O?22?在內(nèi)的活性氧處于較高水平,如同時(shí)有NO生成增多,將與O?22?快速反應(yīng)生成大量的ONOO-。因此,證明肢體I-R后腦組織內(nèi)是否有NO大量產(chǎn)生是本研究的關(guān)鍵問(wèn)題。我們應(yīng)用RT-PCR及免疫組化染色方法分別在基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成水平證實(shí),肢體I-R后腦組織iNOS表達(dá)明顯上調(diào),表明肢體I-R后腦內(nèi)有NO大量生成。用特異性的NT單克隆抗體對(duì)ONOO-的標(biāo)志性產(chǎn)物NT進(jìn)行標(biāo)記染色,結(jié)果顯示,I-R組腦組織內(nèi)有大量NT陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞,說(shuō)明在肢體I-R過(guò)程中腦內(nèi)有ONOO-過(guò)量生成。本實(shí)驗(yàn)I-R6h組腦組織SOD活性顯著下降可能