登革病毒病毒復(fù)制復(fù)合體的形成機(jī)制

登革病毒病毒復(fù)制復(fù)合體的形成機(jī)制

病毒登格病毒（den）是一種小的動(dòng)物病毒。它的基因是一種單帶正鏈流的病毒，長(zhǎng)約11公斤。由單一的開(kāi)放讀碼框(openreadingframe,ORF)編碼一個(gè)約含3400個(gè)氨基酸殘基的多聚蛋白(polyprotein),順序?yàn)?′-C-prM-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3′,由病毒和宿主蛋白酶負(fù)責(zé)對(duì)其進(jìn)行協(xié)同翻譯和翻譯后加工,最后形成3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(C、prM和E蛋白)和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。20世紀(jì)80年代以來(lái),由登革病毒引起的登革熱和登革出血熱在世界范圍的流行、暴發(fā)日益頻繁,我國(guó)南方自1978年以來(lái)每隔幾年就暴發(fā)一次。為了有效控制登革熱的傳播和流行,必須對(duì)病毒的感染及復(fù)制周期有一個(gè)全面的了解。有關(guān)登革病毒生活周期的基礎(chǔ)研究目前越來(lái)越深入,本文將對(duì)這些研究進(jìn)展作一綜述。1den病毒中的rgd序列及整合素登革病毒感染的早期現(xiàn)象是病毒的吸附及穿入。病毒吸附蛋白(virionattachmentprotein,VAP)與細(xì)胞膜表面特異性病毒受體的結(jié)合往往決定了病毒的組織、細(xì)胞親嗜性及隨后的一系列病理反應(yīng),登革病毒的VAP為包膜蛋白E,含494個(gè)氨基酸及2個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn),12個(gè)保守的半胱氨酸殘基,具有多個(gè)中和性表位,其中某些表位可能直接參與病毒包膜與宿主細(xì)胞的融合過(guò)程,其余的表位可能直接參與病毒-細(xì)胞受體分子的結(jié)合。在人體內(nèi)DEN病毒侵犯的重要靶細(xì)胞類(lèi)型為單核細(xì)胞、組織及骨髓細(xì)胞,在這些細(xì)胞中較易檢測(cè)到高滴度的DEN病毒。DEN病毒與特異性細(xì)胞受體的結(jié)合依賴(lài)于E蛋白的二聚體結(jié)構(gòu),隨后病毒包膜與細(xì)胞膜融合,該過(guò)程受包膜附近的低pH介導(dǎo),使E蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變,由二聚體形成三聚體。對(duì)登革病毒E蛋白研究的逐步深入推動(dòng)了細(xì)胞特異性受體的研究。黃病毒中TBE病毒E蛋白通過(guò)X射線(xiàn)晶體衍射技術(shù)已明確了其三維結(jié)構(gòu)。由于DEN病毒E蛋白與TBE病毒E蛋白具有60%的同源性,通過(guò)ProMod及Swiss-Model軟件,可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)DEN病毒E蛋白的三維結(jié)構(gòu)如下:E蛋白以延伸的二聚體形式平躺在病毒表面,折疊成3個(gè)不同的區(qū)域,Ⅰ區(qū)是一個(gè)β-桶狀中心結(jié)構(gòu),由氨基及羧基端序列產(chǎn)生;Ⅱ區(qū)形成一個(gè)延伸的指狀結(jié)構(gòu),可能與E蛋白二聚體的形成及膜融合過(guò)程相關(guān),Ⅲ區(qū)為IgG免疫球蛋白樣折疊,由羧基末端區(qū)形成且延伸至病毒表面,具有與粘附分子中的整合素結(jié)合區(qū)域(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸),簡(jiǎn)稱(chēng)RGD序列。目前已知口蹄疫病毒(FMDEN)、柯薩奇病毒及腺病毒均通過(guò)RGD依賴(lài)的方式與整合素結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞,因此DEN病毒中的RGD序列的存在使人不由想到這些病毒-細(xì)胞間的相互作用與整合素的參與有關(guān)。而實(shí)際情況并非如此,黃熱(YF)病毒17D株的包膜蛋白亦具有一個(gè)可溶性的外露RGD序列,最近研究表明將RGD序列突變?yōu)镽AD或RAE序列后,能完全破壞RGD序列與整合素的相互作用,將這些突變引入全長(zhǎng)cDNA克隆,體外轉(zhuǎn)錄后,將突變體RNA轉(zhuǎn)染C6/36細(xì)胞,于30℃培養(yǎng)幾天后,可觀察到細(xì)胞病變且培養(yǎng)上清中可檢測(cè)到突變病毒子,說(shuō)明突變的RNA基因組可在蚊細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和傳播;將此培養(yǎng)上清于37℃接種BHK-21細(xì)胞并培養(yǎng),BHK-21細(xì)胞可被感染,但不能傳播至鄰近的細(xì)胞。此外,加入高濃度體外合成的RGD多肽,也不能阻止YFV-17D感染原代雞胚成纖維細(xì)胞。這些結(jié)果表明RGD序列介導(dǎo)的整合素結(jié)合過(guò)程在黃病毒與細(xì)胞吸附及穿入過(guò)程中并不起主要作用。另有實(shí)驗(yàn)表明,MVE病毒在人SW13細(xì)胞連續(xù)傳代,獲得的RGD→RGG、RGH突變體是減毒株,究其原因,發(fā)現(xiàn)RGD突變株產(chǎn)生的E蛋白在37℃不穩(wěn)定。以上突變可能影響了E蛋白的折疊過(guò)程,也可能使E蛋白不能二聚體化或不能與prM蛋白相互作用,導(dǎo)致了降解,由此可見(jiàn)RGD序列對(duì)E蛋白構(gòu)象的維持起重要作用,但黃病毒的細(xì)胞受體并非為整合素。Chen等認(rèn)為DEN病毒與表達(dá)在基質(zhì)及細(xì)胞膜上的糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAGs)的結(jié)合介導(dǎo)了病毒的吸附?？扇苄訥AGs能拮抗重組DEN病毒E蛋白與Vero細(xì)胞的結(jié)合過(guò)程,如肝素的半數(shù)抑制劑量(ID50)為0.3μg/ml,可見(jiàn)E蛋白與肝素具有較高的親和性。由于肝素并非是細(xì)胞膜的組成部分,而與其具有結(jié)構(gòu)同源性的硫酸乙酰肝素(heparansulfate,HS)廣泛存在于細(xì)胞表面及其基質(zhì),它們的一級(jí)結(jié)構(gòu)均為重復(fù)的二糖單位。也許DEN病毒的靶細(xì)胞受體為HS,且HS的硫酸化對(duì)E蛋白與受體的結(jié)合是必需的。將Vero細(xì)胞培養(yǎng)在含氯酸鈉(硫酸化抑制劑)的培養(yǎng)基中,此時(shí)細(xì)胞的存活性并不受影響,但細(xì)胞與E蛋白的結(jié)合被抑制?？扇苄缘母叨攘蛩峄疕S能87%拮抗DEN病毒的感染。通過(guò)對(duì)E蛋白與GAGs的結(jié)合序列進(jìn)行預(yù)測(cè)(在富含堿性氨基酸的區(qū)域找出被轉(zhuǎn)角分開(kāi)的某個(gè)區(qū)域,它們?nèi)魧?duì)合在一起則認(rèn)為是GAGs結(jié)合序列),得出E蛋白具2個(gè)GAGs結(jié)合區(qū):E284～310氨基酸,位于Ⅰ區(qū)側(cè)面及Ⅲ區(qū)的終端;E386～411氨基酸,位于Ⅲ區(qū)尾部,與前者的C端共同形成暴露在外的受體結(jié)合位點(diǎn),Rey等認(rèn)為DEN病毒E蛋白(281～423氨基酸)具有潛在的靶細(xì)胞結(jié)合活性。由于各種細(xì)胞來(lái)源的HS呈現(xiàn)高度的異質(zhì)性,表現(xiàn)在一級(jí)結(jié)構(gòu)及硫酸化水平的差異,對(duì)DEN病毒選擇性組織親嗜性也許可以如下解釋:高硫酸化的HS能促進(jìn)E蛋白的結(jié)合與感染,而低硫酸化的HS抑制E蛋白與細(xì)胞的結(jié)合。但近來(lái)的研究表明DEN病毒的穿入也許還需要其他高親和力受體存在,如單純性皰疹病毒Ⅰ型感染成纖維細(xì)胞時(shí),其特異性受體為生長(zhǎng)因子受體,而HS則作為一個(gè)輔助分子起作用。以上研究均是在非人細(xì)胞系上進(jìn)行的。對(duì)兩株與DEN-2高度親和的人白細(xì)胞系(髓單核細(xì)胞系HL60及非EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系BM13674)的研究也表明GAGs參與病毒-細(xì)胞間的相互作用,但不可能是唯一方式。Bielefeldt-Ohmann認(rèn)為肝素是高度帶電分子,它抑制DEN-2與細(xì)胞的結(jié)合可能是通過(guò)非特異性干擾VAP-細(xì)胞受體的相互作用而實(shí)現(xiàn)的。目前較為合理的解釋是HS使登革病毒粘附至細(xì)胞上,粘附作用的增強(qiáng)還需要特異性高親和力受體存在,并最終介導(dǎo)登革病毒進(jìn)入細(xì)胞。登革病毒的另一類(lèi)受體為病毒特異性IgG及IgM類(lèi)抗體,抗體分子雖然不是細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu),但仍可作為一類(lèi)十分特殊的病毒受體介導(dǎo)病毒的吸附和穿入。通常人及靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的單核巨噬細(xì)胞雖可感染DEN,但細(xì)胞只能有限度地支持病毒的繁殖。如在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中加入亞中和濃度的抗DEN單克隆抗體,可導(dǎo)致病毒的大量復(fù)制,通常病毒產(chǎn)量可增加20～1000倍,這種現(xiàn)象稱(chēng)為抗體依賴(lài)性增強(qiáng)作用(ADE)。其基本原理是:抗體的Fab段與病毒特異結(jié)合,而抗體的Fc段則與細(xì)胞表面的FcR結(jié)合,形成病毒-抗體-細(xì)胞復(fù)合體,從而介導(dǎo)病毒的感染,當(dāng)然,ADE作用并不是登革病毒獨(dú)有的,幾乎所有的抗病毒表面抗原表位的抗體均有不同程度的ADE作用,其發(fā)生依賴(lài)于感染細(xì)胞表面存在的FcR。此外,補(bǔ)體受體(C3R)也能引起登革病毒感染增強(qiáng)作用。2病毒rna的形成DEN病毒的復(fù)制過(guò)程發(fā)生在感染細(xì)胞胞漿,正鏈RNA合成的循環(huán)模板是復(fù)制型(RF)RNA,為雙鏈RNA(dsRNA),在病毒復(fù)制周期中正鏈RNA大約是負(fù)鏈RNA的10～100倍。在DEN-2病毒感染細(xì)胞中可觀察到病毒誘生的膜結(jié)構(gòu)。通過(guò)免疫金標(biāo)記及一系列的生化分析表明KUN病毒感染Vero細(xì)胞后,能誘生一系列獨(dú)特的膜結(jié)構(gòu),病毒的復(fù)制復(fù)合體(replicationcomplex,RC)存在于膜泡群(vesiclepackets,VP),由dsRNA及NS1、NS2A、NS3、NS4A與NS5蛋白組成,此外,特異的細(xì)胞蛋白(如eF1-α可與3′N(xiāo)TR端的SL結(jié)構(gòu)相互作用)也可能參與病毒的復(fù)制過(guò)程。黃病毒誘生的膜結(jié)構(gòu)雖然早有報(bào)道,但長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)這些膜的細(xì)胞內(nèi)起源及其在感染中所起的作用并不了解。最近采用免疫熒光及冷凍免疫電鏡技術(shù)顯示NS2B及NS3(病毒蛋白酶復(fù)合體)與NS4A共定位于誘生的卷曲膜(convolutedmembranes,CM)及次晶態(tài)排列(paracrystallinearrays,PC),而復(fù)制復(fù)合體定位于VP。其他蛋白如C蛋白及NS4B則與增殖的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相連,然后再轉(zhuǎn)位至胞核。進(jìn)一步對(duì)KUN病毒感染后的膜形成動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)存在膜成分的重排,包括粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(RER)、中間腔(intermediatecompartment,IC)及反式高爾基體的膜成分。重排或誘生的結(jié)構(gòu)具物理上的連接,并且在病毒復(fù)制周期中有各自明確的功能。正鏈RNA的翻譯發(fā)生在RER,首先產(chǎn)生多聚蛋白前體,隨后在ER腔進(jìn)行信號(hào)肽的切割,CM及PC膜結(jié)構(gòu)中存在的NS2B/NS3蛋白酶對(duì)大部分NS區(qū)蛋白的切割產(chǎn)生單個(gè)的NS蛋白,它們可仍然滯留于CM/PC(如NS2B、NS3及NS4A)內(nèi),也可進(jìn)一步轉(zhuǎn)運(yùn)至VP(如NS1、NS3、NS5、NS2A及NS4A),或者移至胞核(NS4B)。病毒蛋白從RER向高爾基體的運(yùn)動(dòng)對(duì)膜的誘生是必需的,CM膜與PC膜可相互轉(zhuǎn)換,它們均來(lái)自IC,而VP膜則誘生于反式高爾基體的膜成分。位于VP膜內(nèi)的復(fù)制復(fù)合體又是如何形成并啟動(dòng)負(fù)鏈RNA的合成呢?這方面的研究得益于穩(wěn)定的KUN感染性全長(zhǎng)cDNA克隆FLSDX的建立及能永久表達(dá)KUN病毒復(fù)制子RNA的BHK細(xì)胞系repBHK的建立,前者使突變基因的引入變得容易,后者則有利于反式互補(bǔ)作用的研究。KUN病毒復(fù)制子RNA為缺失了病毒的大部分結(jié)構(gòu)區(qū)基因(僅保留了C蛋白的前60個(gè)核苷酸)的亞基因組RNA,能在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中復(fù)制,這說(shuō)明RNA的復(fù)制只需NS蛋白即可。對(duì)黃病毒NS1蛋白亞細(xì)胞定位顯示大部分NS1緊密結(jié)合在病毒誘生的VP膜上,Muglaert等進(jìn)一步證實(shí)了YFV-NS1溫度敏感突變株能阻斷其基因組RNA的擴(kuò)增。黃病毒NS3蛋白具有絲氨酸蛋白酶(serineprotease)活性及核苷三磷酸酶活性(nucleosidetriphosphatase,NTPase)、RNA解旋酶活性(RNAhelicase),前者的功能結(jié)構(gòu)域位于NS3蛋白N端的1/3區(qū),主要負(fù)責(zé)多聚蛋白的翻譯后加工,產(chǎn)生成熟的病毒蛋白,這是病毒自我復(fù)制和組裝的前提條件;后者的功能域位于C端的2/3區(qū),主要參與病毒RNA的復(fù)制過(guò)程。黃病毒NS5蛋白具有非特異性RNA依賴(lài)的RNA聚合酶(RdRp)活性,包括8個(gè)保守的RdRp序列,其中之一為GDD序列(Gly-Asp-Asp),另有2個(gè)保守的具甲基轉(zhuǎn)移酶特性的MT序列,在全長(zhǎng)cDNA克隆FLSDX中分別缺失GDD序列和一個(gè)MT序列(S-腺苷甲硫氨酸位點(diǎn)),產(chǎn)生FLdGDD、FldSAM構(gòu)建體,將它們的體外轉(zhuǎn)錄本導(dǎo)入BHK細(xì)胞,結(jié)果這些RNAs完全失去復(fù)制能力,可見(jiàn)GDD序列及MT序列對(duì)NS5功能的發(fā)揮是必不可少的。如果將它們的體外轉(zhuǎn)錄本導(dǎo)入repBHK細(xì)胞,則可產(chǎn)生僅能在repBHK細(xì)胞中復(fù)制的缺失病毒。這是因?yàn)閞epBHK細(xì)胞內(nèi)能穩(wěn)定產(chǎn)生輔助復(fù)制復(fù)合體,缺失GDD及MT序列形成的缺失型復(fù)制復(fù)合體能與輔助復(fù)制復(fù)合體有效地交換成分,其中的輔助NS5可結(jié)合至缺失RNA模板啟動(dòng)復(fù)制。通過(guò)對(duì)KUN病毒NS5基因的進(jìn)一步缺失研究表明,將感染性全長(zhǎng)cDNA克隆NS5基因羧基端5%、34%、56%的區(qū)域缺失后,體外轉(zhuǎn)染repBHK細(xì)胞,均有缺陷病毒分泌,其中將NS5基因羧基端缺失56%的構(gòu)建體缺失了全部的RdRp區(qū)。而將缺失NS5基因氨基端的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染repBHK細(xì)胞后,NS5的功能不能被有效互補(bǔ)。通過(guò)比較黃病毒NS5蛋白N端的氨基酸序列,找到了3個(gè)高度保守區(qū):a區(qū)(141～151氨基酸),b區(qū)(203～223氨基酸),c區(qū)(343～365氨基酸),這3區(qū)缺失的RNA不能在repBHK細(xì)胞復(fù)制。由此可以設(shè)計(jì)一個(gè)這樣的復(fù)制模型(圖1,2):在翻譯過(guò)程中,黃病毒NS5蛋白的N端通過(guò)保守序列(a區(qū)、b區(qū)、c區(qū))與NS3和NS2A相互作用,于基因組RNA的3′N(xiāo)TR啟動(dòng)復(fù)制復(fù)合體的形成。然后RNA模板與已形成的不成熟復(fù)制復(fù)合體運(yùn)輸至VP膜上某個(gè)錨定區(qū),以形成完整的復(fù)制復(fù)合體,并在此處啟動(dòng)負(fù)鏈RNA的合成。復(fù)制復(fù)合體一旦形成即以活性狀態(tài)穩(wěn)定存在,不需要新翻譯的NS蛋白的補(bǔ)充。NS2A的作用可能是將病毒的RNA及復(fù)制復(fù)合體靶向VP膜,NS4A是一個(gè)跨膜蛋白,以二聚體形式存在,NS1與NS4A的腔內(nèi)部分直接結(jié)合,可誘導(dǎo)NS4A的構(gòu)象發(fā)生變化,然后NS4A及NS2A通過(guò)疏水相互作用結(jié)合,形成的完整復(fù)制復(fù)合體發(fā)生結(jié)構(gòu)重排,使其中NS5的RdRp區(qū)與正鏈RNA結(jié)合,啟動(dòng)負(fù)鏈RNA的合成。根據(jù)上述推測(cè)的復(fù)制模型可以看出,缺失NS5蛋白的C端并不阻止它與其他NS蛋白的相互作用,但最終形成的是缺陷型復(fù)制復(fù)合體。通過(guò)互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)缺陷型復(fù)制復(fù)合體仍能將缺失了NS5基因C端的RNA運(yùn)送至repBHK細(xì)胞內(nèi)輔助復(fù)制復(fù)合體合成位點(diǎn),此過(guò)程可能由NS2A引導(dǎo)。缺陷型復(fù)制復(fù)合體通過(guò)與輔助復(fù)制復(fù)合體或其中成分交換,從而啟動(dòng)缺失了NS5基因C端的負(fù)鏈RNA合成。該模型是否真實(shí)反映了黃病毒的復(fù)制事件尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。3檢查病毒幾何質(zhì)量及重組病毒顆粒DEN病毒的核衣殼由衣殼蛋白C及基因組RNA構(gòu)成,其中C蛋白含大量的Lys和Arg殘基,這些堿性氨基酸可部分中和RNA的負(fù)電荷。使用DEN-2及DEN-4衣殼蛋白C的單克隆抗體可檢測(cè)到C蛋白存在于感染細(xì)胞的胞漿、胞核膜及核內(nèi),目前對(duì)C蛋白具有的核定位位點(diǎn)重要性及其與病毒形態(tài)發(fā)生的關(guān)系尚不清楚。DEN病毒組裝的第一步發(fā)生在ER膜相關(guān)位置。C及PrM蛋白連接處的內(nèi)部信號(hào)序列指導(dǎo)prM蛋白穿越ER膜并定位于ER腔。NS2B/NS3催化C蛋白羧基端在胞漿側(cè)的切割,此過(guò)程使以隱蔽構(gòu)象存在的prM信號(hào)肽在轉(zhuǎn)位通道前后作布朗運(yùn)動(dòng),然后被位于ER膜腔側(cè)的信號(hào)肽酶識(shí)別。同樣prM-E連接處的切割也由ER內(nèi)的信號(hào)肽酶介導(dǎo)。如果將prM信號(hào)肽的羧基端用理想的信號(hào)肽酶識(shí)別序列VPQAQA取代,可使C-prM連接處無(wú)需先經(jīng)NS2B/NS3在胞漿切割,信號(hào)肽酶即可發(fā)揮作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽酶對(duì)prM的切割功能的確加強(qiáng)了,同時(shí)感染性病毒顆粒的產(chǎn)量也大大降低。進(jìn)一步研究表明,VPQAQA突變體并不影響病毒復(fù)制的早期過(guò)程(病毒RNA及蛋白質(zhì)合成),可能影響的是發(fā)生在ER膜上黃病毒的組裝。該突變體導(dǎo)致C蛋白以膜錨定形式存在,可能它不能作為NS2B/NS3的底物,這對(duì)病毒的組裝影響極大,因?yàn)殄^定蛋白是病毒粒子C蛋白的前體,前者向后者的轉(zhuǎn)換可啟動(dòng)核衣殼在胞漿的組裝。DEN病毒粒子組裝的第二步是形成一個(gè)未成熟顆粒,E蛋白與prM蛋白非共價(jià)相連成異源二聚體,其中prM起伴侶分子的作用,可阻止未成熟病毒顆粒在通過(guò)酸性膜泡分泌過(guò)程中,E蛋白構(gòu)象發(fā)生不可逆變化。隨后prM蛋白內(nèi)部,受宿主弗林蛋白酶(furin)的切割,裂解產(chǎn)生M蛋白,引發(fā)病毒顆粒表面的E蛋白形成同源二聚體,最終產(chǎn)生成熟的病毒顆粒。只有含M蛋白的病毒顆粒才能介導(dǎo)病毒與細(xì)胞間在酸性pH條件下的融合。初步認(rèn)為登革病毒顆粒組裝過(guò)程如下:在蛋白合成過(guò)程中E、prM插入RER膜;C蛋白與病毒的RNA在胞漿中裝配成核衣殼,并集中于ER膜的細(xì)胞漿側(cè)。核衣殼可能通過(guò)芽生方式獲得包膜,非成熟病毒顆粒在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組裝,然后進(jìn)一步轉(zhuǎn)運(yùn)到反式高爾基體,對(duì)E蛋白及prM蛋白的糖側(cè)鏈進(jìn)行加工,通過(guò)細(xì)胞分泌途徑運(yùn)輸至胞外。在釋放前,prM裂解產(chǎn)生M蛋白,E蛋白同源二聚體化形成成熟的病毒顆粒。登革病毒prM、E蛋白糖側(cè)鏈的加工對(duì)病毒糖蛋白的正確折疊有重要意義。DEN-