脛骨內(nèi)接種mrm-1細胞制作乳腺癌骨轉(zhuǎn)移大鼠模型的研究

脛骨內(nèi)接種mrm-1細胞制作乳腺癌骨轉(zhuǎn)移大鼠模型的研究

乳腺癌的骨轉(zhuǎn)移可能導(dǎo)致高血鈣、疼痛和病理性骨折，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，并引起臨床和基礎(chǔ)研究人員的注意。在基礎(chǔ)研究中建立接近自然發(fā)病過程的動物模型十分重要,目前乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的造模方法大致有四類,包括自發(fā)性、化學誘導(dǎo)性、轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)性和移植性乳腺癌骨轉(zhuǎn)移動物模型,其中以移植性模型應(yīng)用最為普遍。目前國內(nèi)的移植性骨轉(zhuǎn)移模型多采用裸鼠,但裸鼠體積較小,造模時操作困難,且存在價格較貴、飼養(yǎng)條件要求較高、取材少等不足。譚煌英博士在國內(nèi)最先成功引進了乳腺癌骨轉(zhuǎn)移大鼠模型。大鼠模型在形體、取材量、費用等方面存在明顯優(yōu)勢。本研究小組對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移進程中的多個重要環(huán)節(jié)進行了研究,探討了這一模型的特點,介紹如下:1材料表面1.1動物雌性SD大鼠,SPF級,體重150～160g,合格證號SCXK(京)2007-0001,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。1.2細胞MRMT-1轉(zhuǎn)移性大鼠乳腺癌細胞株由日本東北大學加齡醫(yī)學研究所醫(yī)用細胞資源中心引進。1.3抗體和pcr引物抗酒石酸酸性磷酸酶染色試劑盒由美國SigmaAldrich公司生產(chǎn);抗PCNA抗體由美國CellSignalingTechnology公司生產(chǎn);抗OPG抗體和抗RANKL抗體由美國SantaCruzBiotechnology公司生產(chǎn)。dNTP、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、重組RNA酶抑制劑和隨機引物均由美國Promega公司生產(chǎn);PCR引物由上海英駿(Invitrogen)生物技術(shù)有限公司合成;SYBRPremixExTaq由寶生物(大連)工程有限公司生產(chǎn)。1.4醫(yī)用x光診斷系統(tǒng)21G/22G注射器針頭由美國BectonDickinson(BD)公司生產(chǎn)。VonFrey纖維由美國NorthCoastMedical公司生產(chǎn);大鼠失能測量儀由意大利2Biological公司生產(chǎn)。KXO-32R醫(yī)用X光診斷系統(tǒng)由日本Toshiba公司生產(chǎn);Prodigy雙能X線骨密度儀由美國GeneralElectric(GE)公司生產(chǎn)。IX71型倒置顯微鏡和DP70數(shù)碼成像系統(tǒng)由日本Olympus公司生產(chǎn)。SIGMA3-18K低溫離心機由德國Sartorius公司生產(chǎn);ND-1000紫外分光光度計由美國Nanodrop公司生產(chǎn);AlphaImager2200凝膠成像系統(tǒng)由美國AlphaInnotech公司生產(chǎn);PTC基因擴增儀由美國MJRearch公司生產(chǎn);ABI7300熒光實時定量PCR儀由美國AppliedBiosystems公司生產(chǎn)。2方法2.1傳代培養(yǎng)造模前1周對液氮中凍存的MRMT-1細胞進行復(fù)蘇和傳代培養(yǎng)。造模當天對培養(yǎng)瓶中貼壁生長的細胞進行胰酶消化,收集細胞懸液,洗滌計數(shù)后配制成濃度為1×106個/ml的細胞懸液,造模前置于冰上備用。2.2細胞輸注模型組雌性SD大鼠分2批飼養(yǎng),每批適應(yīng)1周后按照體重分層,隨機分為假手術(shù)組和模型組,每組共16只。造模步驟:將大鼠腹部向上置于鼠板上,左后肢皮毛用生理鹽水濕潤后剪毛,然后使用75%醫(yī)用酒精消毒。取手術(shù)刀片切開脛骨上部的皮膚和肌肉,切口長度約1cm,暴露左脛骨內(nèi)側(cè)面。在膝關(guān)節(jié)以下約5mm處的脛骨內(nèi)側(cè)面,先用21G或22G針頭穿刺打孔,針頭穿透骨皮質(zhì)進入骨髓腔后,使用微量注射器吸取生理鹽水(假手術(shù)組)或配制好的癌細胞懸液3μl(模型組,細胞數(shù)約為3×103),緩慢注射入大鼠骨髓腔內(nèi)。撤出微量注射器后迅速用骨蠟(在50～52℃水浴中保溫)密封針孔以防癌細胞懸液從骨髓腔溢出?？p合肌肉和皮膚。造模當天記為第0天。2.3體重測量在造模前1天用電子天平稱量體重,實驗過程中每周稱重1次并記錄。2.4機械痛覺超敏試驗在造模后第19天進行疼痛測定。通過50%縮足閾值(50%PWT)顯示機械痛覺超敏,通過大鼠失能測量儀測定的雙側(cè)后肢負重差異表示機械痛覺過敏。熱縮足反射潛伏期(TWL)用于評價熱痛覺過敏。2.4.1左下肢眼底中心部位pwt的計算將大鼠置于金屬網(wǎng)上,使用有機玻璃罩限制其活動,待梳理探究活動基本消失后,用標準化的VonFrey纖維刺激左后肢足底中心部位,采用up-down法計算50%PWT。2.4.2雙術(shù)后負重量對比將大鼠放置在大鼠失能測量儀特制的有機玻璃小室內(nèi),前肢趴在斜面上,雙后肢分別踩著2個相互獨立的傳感器,讓動物適應(yīng)1～2分鐘后開始測量,測量時間為5秒,完畢后儀器即可顯示出雙后肢負重值。每只動物連續(xù)測3次,取算術(shù)平均值,對比雙側(cè)后肢負重量并計算差值:兩側(cè)后肢負重差值=右側(cè)負重量-左側(cè)負重量2.4.3TWL在熱痛刺激儀的燈座上架放厚度為3mm的玻片,將大鼠置于玻片上,調(diào)整射燈使其聚焦在大鼠左后肢足底,記錄從照射開始至大鼠出現(xiàn)縮足的時間,如果照射10秒大鼠仍未縮足則自動斷開以免灼傷。每只大鼠測3次,間隔2分鐘以上,最后取算術(shù)平均值。2.5術(shù)后大鼠腫瘤長度和短徑觀察造模后第21天進行取材,取材前已禁食10小時。使用0.45%戊巴比妥鈉溶液按照1ml/100g體重腹腔注射,將大鼠麻醉。稱量體重后處死大鼠,剪下左后肢。對于第1批飼養(yǎng)的大鼠,將剪下的左后肢直接置于4%多聚甲醛中進行固定,待X線檢查后剝離皮膚和肌肉,用游標卡尺測定腫瘤長徑和短徑。按下列公式計算腫瘤體積:腫瘤體積=(腫瘤長徑×腫瘤短徑2)/2對于第2批飼養(yǎng)的大鼠,剪下左后肢后立即將皮膚和肌肉組織剝離,暴露出帶有轉(zhuǎn)移腫瘤的脛骨,迅速測量腫瘤長、短徑,使用經(jīng)過RNA酶處理的手術(shù)剪剪下小塊骨轉(zhuǎn)移瘤組織置于液氮中凍存。2.6骨皮質(zhì)結(jié)構(gòu)正常對多聚甲醛固定后的大鼠后肢進行X線攝片(電壓50kV,曝光時間2ms),對骨質(zhì)破壞程度評分,標準如下:0分:骨結(jié)構(gòu)正常,無任何骨質(zhì)破壞的征象。1分:脛骨注射部位附近可見小型骨質(zhì)缺損病灶(數(shù)量少于3個)。2分:髓質(zhì)骨缺損,病灶增多(數(shù)量大于3個)。3分:髓質(zhì)骨缺失,同時皮質(zhì)骨受侵。4分:單面的骨皮質(zhì)完全缺損。5分:雙面的骨皮質(zhì)缺失,移位性骨折。注:左側(cè)為假手術(shù)組,骨皮質(zhì)完整;右側(cè)為模型組,本例骨皮質(zhì)侵蝕嚴重2.7軟骨和骨轉(zhuǎn)移腫瘤在X線檢查后將固定的大鼠后肢剝?nèi)テつw和肌肉組織,保留完整的脛骨和骨轉(zhuǎn)移腫瘤。將待測標本置于一個盛滿水的塑料盒中,放在Prodigy雙能X線骨密度儀的平臺上掃描,計算骨礦物質(zhì)含量(BMC)和骨密度(BMD)。2.8脫鈣液的更換大鼠脛骨在4%多聚甲醛中固定約10天,然后轉(zhuǎn)入脫鈣液(10%甲醛+EDTA超飽和溶液)脫鈣8周,每1～2周更換脫鈣液1次。脫鈣完成后進行石蠟包埋切片,完成的標本厚度約4μm。2.8.1he染色2.8.2trap細胞計數(shù)按照說明書進行TRAP染色,在IX71顯微鏡下觀察,每張切片在高倍鏡下(×400)隨機選取5個視野,用DP70數(shù)碼成像系統(tǒng)進行圖像采集,然后對這些視野中的TRAP(+)細胞進行計數(shù),取算術(shù)平均值。2.8.3觀察形態(tài)觀察按照說明書對PCNA、OPG和RANKL進行免疫組化染色。在IX71學顯微鏡下觀察形態(tài),每張切片在高倍鏡下(×200)隨機選取3個視野進行拍攝;使用Image-ProPlus(IPP)軟件測定所拍攝的圖像中被染成黃褐色部分的整體光密度(IOD)值,取算術(shù)平均值。2.9rp的mr-na含量從第2批大鼠含腫瘤的脛骨組織中提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄cDNA,用熒光實時定量RT-PCR方法測定甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(PTHrP)的mRNA含量,并以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的mR-NA含量作為內(nèi)參照。引物序列如下(表1):在ABI7300熒光實時定量PCR儀中進行反應(yīng),記錄Ct值,通過比較Ct值方法對兩組樣品所含的PTHrPmRNA進行相對定量,公式如下:目的基因的相對量=2-ΔΔCt其中ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對照組。2.10術(shù)后負重量比較數(shù)據(jù)錄入Excel軟件進行保存,使用SPSS15.0軟件分析。計量資料用均數(shù)±標準差(x±s)表示,采用方差分析進行組間比較。同一組內(nèi)的大鼠兩側(cè)后肢負重量比較采用配對t檢驗進行比較。50%PWT和影像學評分為等級資料;TRAP細胞計數(shù)為頻數(shù)資料,以上3組數(shù)據(jù)用秩和檢驗進行分析。3結(jié)果3.1體重測兩組大鼠造模前體重無差異,顯示基線水平一致,在飼養(yǎng)過程中兩組大鼠體重均逐漸增長,但組間比較仍無差異。3.2疼痛測試3.2.1機械痛覺超敏狀態(tài)模型組50%PWT較假手術(shù)組明顯降低(P<0.01),這提示存在機械痛覺超敏狀態(tài)。假手術(shù)組雙側(cè)后肢負重則較為平衡,模型組出現(xiàn)雙側(cè)下肢負重不平衡的情況(P<0.01);模型組雙側(cè)后肢負重差值明顯高于假手術(shù)組(P<0.01),提示存在機械痛覺過敏。3.2.2熱痛的代價模型組大鼠左足受到熱輻射后的TWL較假手術(shù)組明顯縮短(P<0.01),提示存在熱痛覺過敏的狀態(tài)。3.3腫瘤體積假手術(shù)組無腫瘤生長,因此模型組與之比較差異明顯(P<0.01)。3.4注射部位皮質(zhì)缺損通過X線檢查發(fā)現(xiàn),假手術(shù)組大鼠僅有1只在左脛骨注射部位出現(xiàn)輕度骨質(zhì)缺損,考慮為手術(shù)本身造成的損傷未完全愈合,其余大鼠均呈現(xiàn)正常的骨結(jié)構(gòu),無骨質(zhì)破壞征象,模型組骨質(zhì)受損嚴重(P<0.01)。3.5bmc和bmc兩組間BMC無統(tǒng)計學差異,模型組BMD較假手術(shù)組降低(P<0.05)。3.6骨小梁排列網(wǎng)HE染色可以顯示出兩組大鼠脛骨組織的形態(tài)變化。在低倍鏡(×40)下可見:假手術(shù)組大鼠脛骨結(jié)構(gòu)完整,骨皮質(zhì)連續(xù),骨小梁排列規(guī)則,骨髓腔內(nèi)充滿深染的血細胞。模型組骨髓腔內(nèi)外均可見大量腫瘤細胞浸潤,形態(tài)不規(guī)則,排列紊亂。部分骨皮質(zhì)被腫瘤組織所取代,連續(xù)性中斷,呈現(xiàn)火山口樣結(jié)構(gòu),甚至形成腫瘤組織包圍的孤島狀。骨皮質(zhì)與周邊不成熟的編織骨和軟骨相移行,新生骨組織間隙內(nèi)可見腫瘤細胞,編織骨表面整齊排列一層成骨細胞。3.7模型組和假手術(shù)組trap+細胞的表達情況破骨細胞在TRAP染色下胞漿紅染,即TRAP(+)。假手術(shù)組僅在骨基質(zhì)邊緣見到少量TRAP(+)細胞,通常是單個出現(xiàn)。模型組在被侵蝕的骨基質(zhì)邊緣和瘤體中均可見到成群甚至大群分布的TRAP(+)細胞,大小不一,其中可見多個巨型多核細胞,體積明顯大于假手術(shù)組。通過計數(shù),模型組TRAP(+)細胞均明顯多于假手術(shù)組(P<0.01)。說明模型組出現(xiàn)了破骨細胞過度激活的情況,這是溶骨性骨質(zhì)破壞的核心環(huán)節(jié)。3.8組pcna和rakenl的比較光鏡下免疫組化染色(+)部分呈現(xiàn)黃褐色,使用IPP軟件測量IOD值進行半定量分析,模型組PCNA和RANKL有升高趨勢,但無統(tǒng)計差異。模型組較假手術(shù)組的OPC水平和OPG/RANKL比值下降(P<0.05或P<0.01)。說明在本模型中腫瘤細胞并沒明顯增加RANKL的表達,但會抑制OPG的表達,從而降低OPG/RANKL比值,造成破骨細胞的過度激活。3.9ptrtp的高表達通過比較Ct值的相對定量方法對兩組樣品所含的目的基因PTHrP的mRNA進行相對定量,模型組低于假手術(shù)組(P<0.01),這一結(jié)果說明此模型不具有PTHrP高表達的特征。4乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中pthp的表達本研究使用的乳腺癌骨轉(zhuǎn)移大鼠模型是將MRMT-1大鼠乳腺癌細胞接種至SD大鼠脛骨骨髓腔內(nèi)建成,隨著腫瘤生長,骨質(zhì)逐漸受損,同時伴有癌性骨痛表現(xiàn)。模刨組大鼠在術(shù)后第19天已出現(xiàn)機械痛覺超敏、機械痛覺過敏和熱痛覺過敏,第21天取材后脛骨X線影像顯示明顯的骨質(zhì)破壞、BMD下降,形態(tài)學觀察可見腫瘤在骨髓腔內(nèi)和脛骨周邊呈浸潤性生長,侵蝕破壞骨皮質(zhì),同時伴有不成熟的編織骨和軟骨形成。證實大鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移/癌性骨痛模型已成功建立。有研究顯示,乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者中以溶骨性病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)者占80%～85%。因此,本模型表現(xiàn)出的溶骨性改變是乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的重要特征,其核心環(huán)節(jié)是骨微環(huán)境中各種因素引起的破骨細胞過度激活,導(dǎo)致骨吸收作用失控。破骨細胞起源于單核-巨噬細胞系統(tǒng),通常由多個單核細胞融合并激活才能具有活性,1個活化的破骨細胞可以溶解100個成骨細胞所形成的骨質(zhì)。本項研究通過對破骨細胞的特征性酶TRAP進行染色比較兩組大鼠破骨細胞的數(shù)量和活躍程度,模型組破骨細胞數(shù)量和活性均明顯超過假手術(shù)組(P<0.01),這說明存在破骨細胞的過度激活,這與影像檢查發(fā)現(xiàn)的骨質(zhì)破壞一致,說明破骨細胞的過度激活所導(dǎo)致的骨吸收作用亢進是造成溶骨性病變的直接原因。OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)是破骨細胞活化過程中的一個重要信號傳導(dǎo)通路,此三者均為腫瘤壞死因子家族成員,RANKL是一種激動因子,可通過與破骨前體細胞表面的NF-KB受體激活因子(receptoractivatorofNF-KB,RANK)結(jié)合使之激活從而刺激破骨細胞分化成熟;OPG是RANKL的圈套受體,與RANK競爭RANKL,從而抑制破骨細胞的分化和成熟。RANKL和OPG的水平反映了骨吸收的程度,RANKL過多將增加骨吸收;OPG過多則抑制骨吸收,正常情況下二者處于動態(tài)平衡狀態(tài)。發(fā)生腫瘤骨轉(zhuǎn)移時腫瘤細胞釋放的多種因子破壞了這種平衡,導(dǎo)致破骨細胞過度激活進而促進了骨吸收作用。同時,骨吸收時從骨基質(zhì)中釋放的TGF-β3等因子又會進一步促進腫瘤細胞增殖,從而形成“惡性循環(huán)”。有研究認為乳腺癌細胞可以分泌PTHrP,刺激成骨細胞和基質(zhì)細胞表達RANKL,從而增強破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收作用。本項研究中,PTHrP水平不但未升高反而出現(xiàn)下降,其機制有待更加深入的研究。動物模型是探索乳腺癌骨轉(zhuǎn)移病理機制