補(bǔ)陽還五湯對脊髓損傷大鼠脊髓組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)的影響

補(bǔ)陽還五湯對脊髓損傷大鼠脊髓組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)的影響

骨髓后傷是由細(xì)胞因子引起的各種炎癥細(xì)胞和炎癥因素引起的結(jié)果。雖然所造成的髓損傷超過了原損傷，但具有可逆性，可以由人為干預(yù)控制。利用中藥復(fù)方整體治療優(yōu)勢,以及多途徑、多靶點的藥物作用機(jī)制,抑制多種繼發(fā)性損傷因素,并阻斷脊髓繼發(fā)性病理損傷過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),能夠有效改善脊髓神經(jīng)功能,達(dá)到治療的目的。本實驗從脊髓損傷(SpinalCordInjury,SCI)大鼠脊髓組織病理學(xué)角度,探討補(bǔ)陽還五湯防治SCI的作用機(jī)理,闡明中藥復(fù)方補(bǔ)陽還五湯促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)的臨床應(yīng)用價值。1材料和方法1.1實驗動物標(biāo)準(zhǔn)SPF級Wistar大鼠48只,體質(zhì)量(195±10)g,雌雄各半,由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,實驗動物合格證SCXK(粵)2006-0015/2006B023/2006A052;動物實驗室溫度(23±5)℃,濕度(60±15)%,標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境(實驗動物設(shè)施合格證SYXK(粵)2006-0074)。1.2手術(shù)鉗固定、手術(shù)采用Allen’s打擊法制作中度SCI模型:10%水合氯醛3.5g/kg·W腹腔注射麻醉,背部剪毛,將大鼠俯臥固定于手術(shù)臺上,10%活力碘消毒,以T12棘突為中心取背部正中切口,長約5cm,顯露T11~L1棘突及椎板。用特制的手術(shù)鉗咬除T11下半、T12全椎板及L1上半椎板,以脊髓為中心顯露直徑約2.8mm圓形區(qū),在硬膜表面墊一彎曲度與脊髓表面一致的塑料墊片。用直徑2.4mm、重5g的砝碼從10cm高處,沿細(xì)玻璃導(dǎo)管垂直下落,打擊墊片致T12脊髓急性挫傷,致傷力為5×10gcf(gram·cm·force)。于術(shù)前術(shù)后每日肌注青霉素鈉2萬U,1次/d。術(shù)后單籠飼養(yǎng),用碘伏消毒傷口,每8h按摩膀胱排尿,并及時解除尿路梗阻,直至膀胱功能恢復(fù)。造模前后0d~3周,參照改良后肢運動功能Tarlov評分標(biāo)準(zhǔn)評分:0分,后肢無活動,不能負(fù)重;1分,后肢可見活動,不能負(fù)重;2分,后肢活動頻繁或有力,不能負(fù)重;3分,后肢可支持體重,能走1-2步;4分,可行走僅有輕微障礙;5分,行走正常。1.3模型分組及分組造模后1周,大鼠傷情穩(wěn)定,剔除Tarlov評分<2分和Tarlov評分>3分大鼠共4只,選擇后肢運動功能障礙評分為2~3分的中度SCI大鼠48只,采用分層隨機(jī)方法分組,先按雌雄分層,再根據(jù)體重用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組、補(bǔ)陽還五湯組、金納多組,每組16只,1次/d灌胃2周后結(jié)束實驗。另取16只正常大鼠作為正常組。1.4特芬材料中藥飲片顆粒劑均由廣東一方制藥有限公司提供;金納多采用德國威瑪舒培博士藥廠出品,40mg每片。1.5灌胃給藥、補(bǔ)陽還五湯飲片顆粒劑溶液配制各組大鼠連續(xù)灌服2周,1次/d,每周給藥體積為20mL/kg,用藥組按照3倍臨床等效劑量換算灌胃給藥。補(bǔ)陽還五湯飲片顆粒劑水溶液按《醫(yī)林改錯》原方藥味用量,每錢以3g換算。取相當(dāng)于飲片等量的各味藥的顆粒劑混勻,用100℃蒸餾水配制成含生藥飲片2.00g/mL的水溶液,金納多水溶液用蒸餾水配制成濃度為2.28mg/mL的水溶液,正常組和模型組給予等體積的蒸餾水。1.6灌注鹽水液-l胸腹腔切口,剪開膈肌,剪斷肋骨,夾持胸骨暴露心臟,剪開右心耳,從左心室-主動脈插管灌注生理鹽水,直至右心耳流出清亮液體,再注入4%多聚甲醛200mL固定。從背部原切口進(jìn)入,切取損傷部位及其上下段脊髓組織約2cm,迅速放入EP管中,-70℃冰箱保存。1.7光刻力學(xué)的觀察制片及拍片后,在光鏡下分別以10倍、40倍焦距,觀察脊髓組織的神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性,細(xì)胞形態(tài)、分布、胞膜、胞核的變化情況。1.8顯著性檢驗anoa計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(ue0af±s)表示,采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行檢驗,組間兩兩比較用SNK-q法進(jìn)行檢驗,以P<0.05為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。2結(jié)果2.1模型組與補(bǔ)陽還五湯組的造模后3d1周體重增長比較正常組大鼠體重在0d~3周內(nèi)隨時間增長平穩(wěn)增加。造模損傷使大鼠體重明顯降低,模型組與正常組時間效應(yīng)趨勢比較差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),補(bǔ)陽還五湯組與模型組比較差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),而補(bǔ)陽還五湯組與金納多組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。模型組于造模后3d~3周內(nèi),體重增長緩慢。補(bǔ)陽還五湯組于用藥前即造模后3d~1周體重增長緩慢,與模型組同時間點比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。灌胃給藥后,各組大鼠體重依次為正常組>補(bǔ)陽還五湯組>金納多組>模型組,補(bǔ)陽還五湯組大鼠體重與正常組同時間點比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但與金納多組及模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。2.2病理形態(tài)的變化2.2.1金納多組對不同光鏡下?lián)p傷區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞核固縮的影響正常組:10倍光鏡下可見正常組細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列整齊,脊髓灰、白質(zhì)組織結(jié)構(gòu)完整,神經(jīng)元細(xì)胞在灰質(zhì)中分布均勻、形態(tài)正常,尼氏體清晰,細(xì)胞膜完整,細(xì)胞間基質(zhì)均勻,無神經(jīng)元細(xì)胞壞死現(xiàn)象。見圖1。40倍光鏡下,箭頭標(biāo)示可見神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核染色為藍(lán)黑色,細(xì)胞核完整,在組織中較為緊密的連在一起,胞漿未見滲出。見圖2。模型組:模型組經(jīng)打擊后,10倍光鏡下可見損傷區(qū)出現(xiàn)大片出血,神經(jīng)細(xì)胞胞漿滲出,細(xì)胞腫脹、尼氏體消失、細(xì)胞核呈游散狀態(tài),形成巨大空腔,白質(zhì)區(qū)呈現(xiàn)大量徽囊,呈囊腔樣病變。見圖3。40倍光鏡下還可見損傷的脊髓組織結(jié)構(gòu)變得十分疏松,呈網(wǎng)狀,其中的多個神經(jīng)元已壞死、溶解,箭頭指示可見神經(jīng)元細(xì)胞核固縮嚴(yán)重。見圖4。補(bǔ)陽還五湯組SCI大鼠經(jīng)用補(bǔ)陽還五湯治療后,10倍光鏡下可見部分神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)已基本趨于正常,數(shù)目也增多,組織分布均勻;灰質(zhì)區(qū)仍有少數(shù)的小空腔,偶見新生毛細(xì)血管,少量細(xì)胞核固縮,白質(zhì)區(qū)微囊減少,出現(xiàn)數(shù)量不等的微囊,并偶見新生毛細(xì)血管。見圖5。40倍下光鏡可見部分神經(jīng)元細(xì)胞已趨于正常,細(xì)胞核分布逐漸集中分布,胞漿也逐漸增多。見圖6。金納多組10倍光鏡下觀察可見金納多組損傷區(qū)中神經(jīng)組織分布依舊疏松,仍可見巨大的空腔,出現(xiàn)數(shù)量較多的微囊,神經(jīng)元細(xì)胞核固縮現(xiàn)象有所改善。見圖7。少量細(xì)胞形態(tài)正常,空腔較大,神經(jīng)元壞死仍嚴(yán)重,細(xì)胞核固縮明顯。見圖8。2.2.2病理組織學(xué)檢測脊髓損傷后可出現(xiàn)脊髓組織出血、組織疏松、水腫,細(xì)胞胞漿外滲、變性,呈空泡狀,神經(jīng)元細(xì)胞核游離、固縮等嚴(yán)重?fù)p傷現(xiàn)象。經(jīng)補(bǔ)陽還五湯治療后,上述變化均有不同程度的恢復(fù),其中以空泡變性減輕,神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)恢復(fù),細(xì)胞核分布排列趨于完整尤為明顯,與金納多組和模型組有明顯差別。而金納多組在光鏡下觀察變化又較模型組改善明顯,已有部分細(xì)胞核趨于正常,細(xì)胞核固縮仍然較嚴(yán)重,但改善作用沒有補(bǔ)陽還五湯組明顯。2.3下肢運動功能的taslov評分3補(bǔ)陽還五湯治療特殊大鼠骨髓致病性損傷的臨床作用SCI后,損傷局部血管受損、閉塞、痙攣,血栓形成,微循環(huán)障礙,脊髓組織出現(xiàn)低灌流。創(chuàng)傷性低血壓損傷脊髓的自身調(diào)節(jié)機(jī)制,失去低碳酸反應(yīng),使自身血流量不能維持在正常水平。炎性細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的浸潤,導(dǎo)致局部組織水腫,增加血管阻力,造成灌注紊亂。血管內(nèi)皮損傷或腫脹,可導(dǎo)致微血管的調(diào)節(jié)能力下降,進(jìn)一步加重微循環(huán)障礙及組織缺血程度。由于脊髓局部組織缺血及延遲性低灌流,脊髓神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生壞死,神經(jīng)功能逐漸喪失。在脊髓缺血期和再灌注期,損傷局部組織自由基生成增多,內(nèi)源性抗氧化劑減少,過氧化基團(tuán)生成增多,使神經(jīng)細(xì)胞膜磷脂過氧化,損傷并破壞膜的通透性和完整性,導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的崩解及細(xì)胞內(nèi)成分的釋放,最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞失去神經(jīng)支配功能。本文研究顯示,SCI大鼠脊髓組織通過光鏡檢查可見明顯的出血、水腫、神經(jīng)元變性壞死現(xiàn)象,其損傷的病理變化以神經(jīng)元潰變?yōu)橹?而脊髓的完整性不受破壞。結(jié)果和國內(nèi)外學(xué)者研究一致。在使用補(bǔ)陽還五湯治療后2周,可明顯阻止SCI大鼠脊髓的繼發(fā)性損傷,并促進(jìn)損傷神經(jīng)元的修復(fù),與其擴(kuò)張血管、改善血液流變性和微循環(huán)、抑制血小板聚集、溶解血栓,改善損傷神經(jīng)組織細(xì)胞缺氧損傷等作用有關(guān)。體重分析結(jié)果顯示,正常組大鼠體重在0d~3周內(nèi)平穩(wěn)增加。造模損傷使大鼠體重明顯降低,灌胃給藥3周后,各組大鼠體重大小依次為正常組>補(bǔ)陽還五湯組>金納多組>模型空白組,大鼠體重變化與各組大鼠的病理組織修復(fù)情況基本一致。原因是隨著大鼠神經(jīng)功能的改善,精神狀態(tài)好轉(zhuǎn),食欲增加,體重逐漸增加,在一定程度上佐證了補(bǔ)陽還五湯保護(hù)神經(jīng)功能的作用。通過對體重及病理組織的研究,證實了補(bǔ)陽還五湯對中樞神經(jīng)的保護(hù)作用,其機(jī)制可能為補(bǔ)陽還五湯阻斷了PAF誘導(dǎo)的脊髓繼發(fā)性病理損傷過程,擴(kuò)張組織血管,改善血液流變性和微循環(huán),抑制血小板聚集,溶解血栓和預(yù)防血栓再發(fā),改善組織缺血、缺氧等病理狀態(tài)。同時,由于神經(jīng)損傷局部雪旺細(xì)胞的氧利用率提高,雪旺細(xì)胞的增生和分裂增殖加快,分泌并釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子增多,保護(hù)受損神經(jīng)元。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為,SCI病人乃“氣虛血瘀”,故宜選益氣活血的中藥,以疏通督脈通經(jīng)活絡(luò)。補(bǔ)陽還五湯是治療脊髓或腦部神經(jīng)組織缺血缺氧損傷患者的常用傳統(tǒng)中藥方劑,具有益氣活血、通經(jīng)活絡(luò)的功效,其中地龍、川芎、桃仁、紅花、赤芍等具有明顯的活血化瘀作用。通過補(bǔ)陽還五湯對SCI大鼠體重和后肢運動功能的作用觀察,表明補(bǔ)陽還五湯可明顯改善大鼠SCI后體重下降和病理組織學(xué)的修復(fù),為該方在中醫(yī)“痿證”中的應(yīng)用提供了新的藥理學(xué)依據(jù)。在0d~3周內(nèi),正常組大鼠后肢運動功能Tarlov評分無明顯變化;補(bǔ)陽還五湯組與金納多組評分隨時間變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),與模型組及正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);各時間點組間比較結(jié)果:造模后3d