復(fù)方替米考星納米乳的制備及品質(zhì)評(píng)價(jià)

復(fù)方替米考星納米乳的制備及品質(zhì)評(píng)價(jià)

納米乳液是由油相、水相、乳化劑和輔助乳化劑以適當(dāng)比例混合而成的透明或透明、低粘度動(dòng)態(tài)和力學(xué)穩(wěn)定體系。大量資料表明,納米乳具有制備簡(jiǎn)單,安全性高,熱力學(xué)穩(wěn)定,增加難溶性藥物溶解度,提高易水解藥物穩(wěn)定性,緩釋,靶向,提高藥物生物利用度等優(yōu)點(diǎn)。替米考星(Tilmicosin)是一種以泰樂菌素為前體半合成的大環(huán)內(nèi)酯類畜禽專用抗生素,其抗菌活性與泰樂菌素相似,對(duì)細(xì)菌包括革蘭氏陽(yáng)性菌以及部分革蘭氏陰性菌、支原體螺旋體均有很強(qiáng)的抑制作用,特別對(duì)豬的胸膜肺炎放線桿菌、畜禽巴氏桿菌及支原體具有比泰樂菌素更強(qiáng)的抗菌活性。替米考星極微溶于水,臨床常用其磷酸鹽,該鹽存在吸收不完全,生物利用度低,不能充分發(fā)揮抗菌作用等缺點(diǎn)。因此,亟需提高其水溶性和生物利用度。氟苯尼考(Florfenicol)為人工合成的甲砜霉素單氟衍生物,是新一代氯霉素類動(dòng)物專用廣譜抗生素。其抗菌活性明顯優(yōu)于氯霉素和甲砜霉素,對(duì)支氣管敗血波氏桿菌、鏈球菌、副豬嗜血桿菌、沙門菌、大腸埃希菌等革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌及支原體均有強(qiáng)大的抗菌能力。目前,該藥在獸醫(yī)臨床上應(yīng)用非常廣泛,但該藥幾乎不溶于水,口服生物利用度很低,故提高該藥的生物利用度對(duì)其在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用具有重要意義。另外,隨著用藥的增多,臨床上對(duì)氟苯尼考耐藥的細(xì)菌也開始出現(xiàn),這些耐藥菌株勢(shì)必給臨床治療帶來困難。將替米考星和氟苯尼考進(jìn)行配伍,則會(huì)降低用藥量,減少或延緩耐藥菌株的產(chǎn)生。但目前有關(guān)替米考星和氟苯尼考復(fù)方制劑的研制尚未見報(bào)道。為此,本研究將替米考星和氟苯尼考配伍,制備成復(fù)方替米考星納米乳,并對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行考察,以期為獸醫(yī)臨床提供一種廣譜、高效、安全、穩(wěn)定的納米級(jí)復(fù)方抗菌藥物。1材料和方法1.1藥物、試劑和儀器吐溫-80(Tween80)、司盤-80(Span80),化學(xué)純,天津市登封化學(xué)試劑廠生產(chǎn);蓖麻油聚氧乙烯醚(EL-40)、聚氧乙烯醚-40氫化蓖麻油(RH-40),上海昌為醫(yī)藥輔料技術(shù)有限公司生產(chǎn);乙酸乙酯、無水乙醇、1,2-丙二醇(PG)、1,3-丁二醇和聚乙二醇(PEG400)均為分析純,西安化學(xué)試劑廠生產(chǎn);肉豆蔻酸異丙酯(IPM),藥用級(jí),陜西省醫(yī)藥公司生產(chǎn);亞甲基藍(lán)和蘇丹紅,北京化學(xué)試劑公司生產(chǎn);替米考星原料藥,山東齊魯制藥有限公司生產(chǎn);檸檬酸,天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。JEM1230型透射電子顯微鏡,日本日立電子公司生產(chǎn);EB-280型電子天平,日本shimadzu公司生產(chǎn);TGL-16B型高速離心機(jī),湖南星科科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn);SKP02.420電熱恒溫培養(yǎng)箱,黃山市恒豐醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn);XSZ-HS7偏光顯微鏡,重慶光學(xué)儀器廠生產(chǎn);ZetasizerNanoZS型激光粒度分析儀,英國(guó)MalvernInstrument公司生產(chǎn)。1.2納米乳液的共軛反應(yīng)1.2.1復(fù)方替米考星納米乳的油相的確定取IPM、石蠟油、橄欖油、精制麥芽油、霍霍巴油、大豆油、花生油、乙酸乙酯分別置于具塞錐形瓶中,加入過量的替米考星,37℃水浴條件下超聲(30Hz,50W)溶解20h后,觀察替米考星在油相中的溶解度,確定復(fù)方替米考星納米乳的油相。1.2.2助表面活性劑的確定室溫下,考察PEG400、無水乙醇、丙三醇、1,2-丙二醇、無水乙醇與1,2-丙二醇的混合物[m(無水乙醇)∶m(1,2-丙二醇)=3∶2]對(duì)替米考星的溶解度,確定溶解度較大的作為助表面活性劑。1.2.3納米乳的界面張力表面活性劑是形成納米乳的關(guān)鍵組分,通過界面吸附,使油水界面張力大幅度下降,甚至降至超低界面張力,促進(jìn)納米乳的形成。以Km表示表面活性劑與助表面活性劑的質(zhì)量比,固定Km值為6∶5,選用Tween80、EL-40、Span80和RH404種非離子表面活性劑進(jìn)行篩選,根據(jù)篩選出的油相、助表面活性劑,繪制偽三元相圖,分別考察它們對(duì)納米乳形成的影響。1.2.4最佳算法確定將表面活性劑與助表面活性劑按2∶1、3∶2、6∶5的質(zhì)量比混勻,作為混合表面活性劑,根據(jù)“1.2.1”、“1.2.2”、“1.2.3”的篩選結(jié)果,繪制偽三元相圖,研究最佳Km值。1.2.5復(fù)方替米考星納米乳的增溶劑的篩選由于替米考星在篩選的油相、乳化劑和助乳化劑中的溶解度不能滿足臨床給藥要求,因此根據(jù)其溶解性質(zhì),篩選復(fù)方替米考星納米乳的增溶劑。分別選取檸檬酸、磷酸、酒石酸作為增溶劑,觀察替米考星在不同增溶劑中的溶解度。以乳化劑/油相/蒸餾水體系為藥用納米乳基質(zhì),考察質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.00%、1.60%、2.00%、2.80%、4.90%、6.30%和10.00%的檸檬酸對(duì)納米乳形成的影響。1.2.6劑、油相質(zhì)量比對(duì)納米乳體系組分內(nèi)含水量的影響選定適當(dāng)?shù)脑鋈軇?、乳化劑和油相?通過偽三元相圖確定復(fù)方替米考星納米乳的形成區(qū)域及處方成分的用量。室溫下,將確定的乳化劑和油相分別按質(zhì)量比9.7∶0.3、9.4∶0.6、9∶1、8.7∶1.3、8.5∶1.5、8∶2和1∶9混勻,然后逐滴加入蒸餾水,直至形成透明、澄清納米乳。記錄當(dāng)體系由混濁變澄清或由澄清變混濁時(shí)的臨界點(diǎn)水量,并計(jì)算體系中各成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。分別以乳化劑、油相、水相作為相圖的3個(gè)頂點(diǎn),利用OriginPro7.5軟件繪制偽三元相圖,確定乳化劑和油相的比例。1.2.7復(fù)方替米考星納米乳的制備根據(jù)配方初步篩選結(jié)果,采用轉(zhuǎn)相乳化法制備復(fù)方替米考星納米乳。具體制備方法:室溫條件下,先將替米考星完全溶于助表面活性劑和增溶劑,再逐滴加入氟苯尼考溶液,然后加入表面活性劑和油相,混勻,逐滴加入蒸餾水,其間不斷攪拌,直至形成均勻透明體系,即復(fù)方替米考星納米乳。1.3聯(lián)合評(píng)價(jià)星納米乳液質(zhì)量分析1.3.1納米乳的判定采用離心法對(duì)納米乳的類型進(jìn)行鑒別。將制備的納米乳于4000r/min離心20min,觀察是否分層,如仍維持透明可判定為納米乳。納米乳類型的鑒別采用染色法,根據(jù)紅色的油溶性染料蘇丹紅Ⅲ和藍(lán)色的水溶性染料亞甲蘭在納米乳中擴(kuò)散的快慢來判斷,如果藍(lán)色的擴(kuò)散速度大于紅色,則納米乳為O/W型;反之則為W/O型,若二者速度相同則為雙連續(xù)型。1.3.2納米乳液電鏡觀察參照文獻(xiàn),用透射電鏡檢測(cè)納米乳的形態(tài),取替米考星納米乳適量,用蒸餾水稀釋10倍后,滴在覆有支持膜的銅網(wǎng)上,靜置10min后用濾紙片吸干,再滴加20g/L磷鎢酸溶液(pH為7.4)于銅網(wǎng)上負(fù)染3min,自然揮干,在電鏡下觀察納米乳液滴的形態(tài)。1.3.3粒度分析取適量復(fù)方替米考星納米乳,用蒸餾水稀釋10倍,用激光粒度分析儀測(cè)定其粒徑分布。1.3.4穩(wěn)定納米乳的檢測(cè)外觀:肉眼觀察納米乳的外觀,若澄清透明,表明穩(wěn)定性良好;若出現(xiàn)渾濁、絮狀沉淀或分層,則表明不穩(wěn)定。高速離心試驗(yàn):將納米乳置于離心管中,放入高速離心機(jī),于13000r/min離心20min,觀察是否有沉淀、渾濁、分層等現(xiàn)象發(fā)生。若外觀透明、流動(dòng)性良好,100g離心5min,若不發(fā)生相分離,即為穩(wěn)定納米乳。加速試驗(yàn):將復(fù)方替米考星納米乳分別于高濕(92.5%)、高溫(40℃)、常溫及光照(4500±500)lx環(huán)境下進(jìn)行影響因素試驗(yàn),于第1天、第5天和第10天取樣,考察其外觀;取納米乳置離心管中,13000r/min下離心20min,觀察是否有沉淀、渾濁、分層等現(xiàn)象發(fā)生。2結(jié)果與分析2.1處方篩選2.1.1油相篩選結(jié)果表明,替米考星在IPM中的溶解度較大,IPM適合做為體系的油相。2.1.2無水乙醇與1,2-丙二醇混合體系的篩選篩選結(jié)果表明,替米考星在無水乙醇或1,2-丙二醇中均有一定的溶解度,在無水乙醇與1,2-丙二醇的混合體系[m(無水乙醇)∶m(1,2-丙二醇)=3∶2]中溶解度最大,故選取此混合體系為助表面活性劑。2.1.3區(qū)域及大小分析以RH40為表面活性劑所制備的溶液不穩(wěn)定,24h后溶液變渾濁。其余3種表面活性劑的納米乳乳區(qū)范圍見圖1(偽三元相圖中曲線和水相頂點(diǎn)圍成的陰影部分即為納米乳乳區(qū))。微乳區(qū)大小表現(xiàn)為Tween80>EL-40>Span80(圖1)。3種表面活性劑所形成的納米乳體系都可以被水稀釋至頂點(diǎn)并保持澄明狀態(tài),但Tween80載藥量最大。因此,選用Tween80為表面活性劑。2.1.4最佳距離值由圖2(陰影部分為納米乳區(qū))可知,Km為6∶5時(shí)微乳區(qū)最大。因此,最佳Km值為6∶5。2.1.5檸檬酸納米乳的穩(wěn)定性質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸不能形成納米乳,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.90%、6.30%和10.00%的檸檬酸能夠形成納米乳,但所形成的納米乳不穩(wěn)定。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.60%、2.00%和2.80%的檸檬酸均能形成納米乳,且形成的納米乳穩(wěn)定,考慮到成本及載藥量因素,選用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.60%的檸檬酸作為增溶劑。2.1.6表面活性劑與油的質(zhì)量比對(duì)納米乳品質(zhì)的影響以替米考星為主藥,氟苯尼考為輔藥,Tween80為表面活性劑,乙醇、1,2-丙二醇為助表面活性劑,檸檬酸、二甲基亞砜為增溶劑,IPM為油相所制備的納米乳,外觀透明、粘度小、性質(zhì)穩(wěn)定。當(dāng)表面活性劑與油的質(zhì)量比為9∶1、Km=6∶5時(shí),制備的納米乳粒徑最小、性質(zhì)最穩(wěn)定,替米考星載藥量最高。由此可知,替米考星納米乳的最佳配方為:替米考星11.07%、氟苯尼考1.11%,二甲基亞砜1.11%、無水乙醇13.29%、1,2-丙二醇8.86%,檸檬酸1.64%,Tween8026.58%、IPM5.32%、蒸餾水31.02%(以上各組分均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))。2.2聯(lián)合評(píng)價(jià)星納米乳液質(zhì)量分析2.2.1復(fù)方替米考星納米乳按上述配方制備的藥液,以4000r/min離心30min后,仍為澄清透明的淡黃色液體,未見分層現(xiàn)象,判定該液體為復(fù)方替米考星納米乳。染色結(jié)果顯示,在復(fù)方替米考星納米乳中亞甲基藍(lán)的擴(kuò)散速度大于蘇丹紅,表明該體系為O/W型納米乳。2.2.2該形狀復(fù)方替米考星納米乳在透射電鏡下呈規(guī)則球形,液滴分布均勻,無團(tuán)聚,無粘連現(xiàn)象(圖3)2.2.3多分散系數(shù)及粒度分布粒度分析儀測(cè)定結(jié)果表明,復(fù)方替米考星納米乳平均粒徑為15.4nm;多分散系數(shù)(PDI)為0.08;粒度分析表明,小于10nm的粒子占3.2%,大于25nm的占4.3%,粒度分布在10～25nm的占92.5%。可見所得納米乳的粒徑分布范圍較窄,基本呈正態(tài)分布(圖4)。2.2.4均一液體穩(wěn)定性試驗(yàn)替米考星納米乳的外觀為淡黃色澄清透明液體,無渾濁、絮狀、分層等現(xiàn)象;13000r/min離心20min后,仍為淡黃色澄清透明均一液體,表明其穩(wěn)定性良好。加速試驗(yàn)表明,在不同時(shí)間取樣觀察,復(fù)方替米考星納米乳外觀仍保持澄清透明,該體系受溫度、光照、濕度影響較小,經(jīng)13000r/min離心20min后仍保持澄清、透明,未見絮狀沉淀,油水分層等現(xiàn)象,說明該納米乳穩(wěn)定性良好。3替米考星與氟苯尼考配伍替米考星和氟苯尼考均是臨床廣上泛使用的抗菌藥物,具有抗菌譜廣,殺菌力強(qiáng),作用迅速等特點(diǎn)。替米考星對(duì)巴氏桿菌、無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、致病性大腸桿菌、沙門氏菌均具有較強(qiáng)的抑制和殺滅作用,主要用于治療動(dòng)物肺炎、急慢性呼吸道疾病和泌乳動(dòng)物的乳腺炎。氟苯尼考對(duì)豬胸膜肺炎放線桿菌、支氣管敗血波氏桿菌、鏈球菌、副豬嗜血桿菌、大腸埃希菌等革蘭陽(yáng)性和陰性細(xì)菌及支原體均有強(qiáng)大的殺傷力。但是,隨著長(zhǎng)期廣泛的使用,許多病原菌已對(duì)這2種藥物產(chǎn)生了耐藥性,從而導(dǎo)致臨床治療效果降低。本試驗(yàn)依據(jù)聯(lián)合用藥理論,將替米考星與氟苯尼考進(jìn)行配伍,通過二者的協(xié)同作用,擴(kuò)大了抗菌譜,增強(qiáng)了抗菌活性,減少了耐藥菌株的產(chǎn)生,同時(shí)為克服替米考星和氟苯尼考溶解性差的缺點(diǎn),提高制劑的穩(wěn)定性,將其制備成納米乳制劑。納米乳制備中最重要的是處方組分及其比例的確定。處方組分及其比例不恰當(dāng),就不能生成納米乳或生成的納米乳區(qū)小,達(dá)不到增加難溶性藥物溶解度、增加藥物穩(wěn)定性、提高生物利用度的目的。納米乳通常由表面活性劑、助表面活性劑、油相、水相等組分在適當(dāng)質(zhì)量比下自發(fā)形成。水、表面活性劑和油相是納米乳形成所必需的處方組分,主要影響納米乳體系的形成、穩(wěn)定性和載藥量。本研究選定檸檬酸為增溶劑,Tween80為表面活性劑、無水乙醇與1,2-丙二醇混合體系為助表面活性劑、IPM為油相,m(混合表面活性劑)∶m(油相)=9∶1,Km=6∶5時(shí),所形成的納米乳澄清均一,體系穩(wěn)定,長(zhǎng)期保存不會(huì)發(fā)生破乳、分層現(xiàn)象,這可能是由于在此質(zhì)量比范圍內(nèi),表面活性劑和助表面活性劑、混合表面活性劑和油相之間能更好地增加界面膜的流動(dòng)性和形成較低的超低界面張力,導(dǎo)致形成粒徑較小、界面膜穩(wěn)定的納米乳體系。無水乙醇和1,2-丙二醇以質(zhì)量比3∶2混合作為助表面活性劑,不但可提高納米乳載體對(duì)替米考星的載藥量,而且1,2-丙二醇具有防腐和降低凝固點(diǎn)的作用,這樣更有利于納米乳體系的低溫保存和穩(wěn)定。4納米乳的表征以替米